鞣花酸经活性氧与血管再生途径对四氯化碳诱导肝硬化的保护作用研究

田　伟，　黄学卿，　王黎洲，　周　石，　安天志，　宋　杰，　蒋天鹏

肝硬化作为一种慢性肝脏系统疾病，表现为弥漫性肝纤维化，伴随假小叶和再生结节形成［1］。临床症状主要表现为肝功能损害和门静脉高压症［2］，晚期可出现消化道出血、肝性脑病和继发感染等严重并发症［3］。其发病机制在我国主要是病毒性肝炎，其它病因包括胆汁淤积、循环障碍、工业中毒、药物滥用、代谢紊乱、营养不良、免疫紊乱及其它未知因素［4］。细胞氧化损伤与许多慢性疾病有关。肝硬化小鼠存在明显的氧化和抗氧化失衡［5］。正常条件下，肝脏中氧化与抗氧化系统处于动态平衡中［6］。某些因素通过激活氧分子引起肝组织脂质过度氧化，从而引起肝损伤［7］，而自由基产生与脂质过氧化协同作用，会产生自由基反应和肝脏损害［8］，进而加重炎性反应和肝损伤［9］。这种病理性改变，被认为是肝硬化患者难治的原因［10］。鞣花酸（ellagic acid，EA）具有多种生物活性，如抗氧化、抗突变、抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）作用［11］，也是一种有效促凝剂，对各种细菌和病毒具有良好抑制作用［12］。它可保护伤口表面免受细菌侵袭和感染，并抑制溃疡形成［13］。有研究表明EA具有降压、镇静作用［14］。本研究旨在探讨EA对四氯化碳（CCl4）诱导肝硬化的保护作用是否是经由活性氧（ROS）和血管再生途径，进而抑制肝硬化病程发展。

1　材料与方法

1.1　动物模型与实验分组

本研究方案获得了医院动物伦理委员会批准。取C57BL/6无特定病原体（SPF）级雄性小鼠（医院实验动物中心提供）40 只，体质量为（20±2） g，均饲养于（25.1±1.0）℃、12 h 为一周期的光/暗交替标准环境；随机分为对照组（n＝10）和肝硬化模型组（n＝30），对照组小鼠仅接受0.9%氯化钠溶液，肝硬化模型组小鼠由橄榄油稀释10%CCl4诱导构建肝硬化（2 mL/kg，腹腔注射，每周3次，连续6周）。肝硬化模型形成第4周，根据EA干预与否及给予剂量，模型组又随机分为未干预组（n＝10）、7.5 mg/kg EA组（n＝10）、15 mg/kg EA 组（n＝10），EA 干预持续 5周。

1.2　血清生化检查

获取肝组织匀浆样品，在110℃6 N氯化氢（HCl）中水解，并在 60℃氯胺（2.5 mg）和范式乙基氨基苯甲醛混合液中孵育30 min；采用560 nm分光光度计（美国Amersham生物科学公司）读取血清谷氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和白蛋白（ALB）水平。

1.3　肝组织病理检查

采集肝组织样本于4%甲醛中固定，梯度乙醇脱水、二甲苯清除乙醇，浸入石蜡制作切片，苏木精-伊红（HE）染色后进行病理学检查。

1.4　胶原蛋白Ⅰ检测

TRIzol试剂（美国Sigma-Aldrich公司）提取肝组织样本中胶原蛋白Ⅰ总RNA，RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒（美国Fermentas生命科学公司）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法合成 2 μg RNA。cDNA扩增使用特异性引物序列：上游5′-CAGAGTGGAAGAGCGATTA-3′， 下 游 5′-CAAGGACAGTGTAGGTGAA-3′；扩增过程在DNA恒温箱（美国Applied Biosystems公司）（95℃ 10 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s，×40 周期，4℃保存）中进行。

1.5　ROS检测

肝组织匀浆标本采集后在10 000 r/min分离机中离心10 s，持续3次，选取其中30 μg蛋白，二辛可酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术公司）检测ROS水平。检测原理为：ROS存在条件下，二氯二乙酸酯（DCFH-DA）被氧化生成二氯（DCF）荧光素，荧光强度与细胞内ROS水平呈正比。

1.6　氧化应激检测

血液标本采集后在12 000 r/min分离机中离心10 min，冷却至室温，用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒及分光光度计（美国Amersham公司）检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性。

1.7　蛋白印迹检测

采集肝组织样本进行均质处理，在10 000 r/min分离10 s，持续3次，BCA试剂盒测定总蛋白。取50 μg蛋白行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至硝酸纤维膜上，用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲液（TBST）封闭2 h，加入抗诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抗体（1︰4 000）、抗血管内皮细胞生长因子（VEGF）抗体（1︰2 500）、抗VEGF 受体（VEGFR）-2 抗体（1︰3 000）、抗 β-肌动蛋白（actin）抗体（1︰5 000，美国 Santa Cruz 生物技术公司）4℃过夜；TBST洗涤3次，加抗鼠IgG抗体（1︰3 000，美国Santa Cruz生物技术公司）室温孵育2 h，TBST洗涤3次，增强型化学发光（ECL）试剂显色，ImageQuantTM400凝胶成像系统（美国通用公司）分析蛋白表达情况。

1.8　半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3活性确定

采集肝组织样本进行均质处理，10 000 r/min下离心10 s，持续3次，BCA试剂盒测定总蛋白。取50 μg蛋白于N-乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-对硝基苯胺（Ac-DEVD-pNA）中室温下培育30 min，ELISA及分光光度计（波长405 nm）检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）-3吸光率。

1.9　统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料均数±标准差（x±s）表示，多组均数两两比较用完全随机单因素方差分析及Tukey事后检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　EA对肝硬化小鼠的作用

血清标本检测显示，肝硬化模型组小鼠血清ALT、AST、ALB水平较对照组明显增高，EA干预5周后肝硬化小鼠 ALT、AST、ALB水平显著下降（P＜0.05）（图 1）。肝脏组织 HE 染色显示，肝硬化模型组小鼠有明显肝硬化细胞改变，EA能有效抑制肝硬化形成过程中细胞形态改变（P＜0.05）（图2）。

图1　各组小鼠血清ALT、AST、ALB水平

图2　各组小鼠肝脏组织HE染色结果

2.2　EA对肝硬化小鼠Ⅰ型胶原蛋白的作用

RT-PCR检测显示，肝硬化模型组Ⅰ型胶原表达水平较对照组显著升高，EA能显著抑制Ⅰ型胶原表达水平（P＜0.05）（图 3）。

图3　各组小鼠Ⅰ型胶原蛋白表达水平

2.3　EA对肝硬化小鼠iNOS蛋白表达的作用

蛋白印迹检测显示，肝硬化模型组小鼠肝脏iNOS蛋白表达水平明显高于对照组，EA干预后iNOS 表达水平明显受抑制（P＜0.05）（图 4）。

2.4　EA对肝硬化小鼠氧化应激的影响

ELISA检测显示，肝硬化模型组小鼠GSH-PX、GSH、SOD、MDA活性水平均较对照组显著抑制，EA干预5周后GSH-PX、GSH、SOD、MDA活性均显著逆转（P＜0.05）（图 5）。

2.5　EA对肝硬化小鼠ROS的影响

ROS检测显示，肝硬化模型组小鼠ROS水平与对照组相比显著升高，EA干预后ROS水平显著受抑制（P＜0.05）（图 6）。

图4　各组小鼠iNOS蛋白表达水平

图5　各组小鼠GSH-PX、GSH、SOD、MDA活性水平

图6　各组小鼠ROS水平

2.6　EA对肝硬化小鼠VEGF、VEGFR-2的影响

蛋白印迹检测显示，肝硬化模型组VEGF、VEGFR-2表达水平与对照组相比显著升高，EA干预后显著抑制 VEGF、VEGFR-2 表达（P＜0.05）（图 7）。

2.7　EA对肝硬化小鼠caspase-3活性的影响

ELISA检测显示，肝硬化模型组caspase-3活性与对照组相比显著升高，EA干预能显著降低caspase-3 活性水平（P＜0.05）（图 8）。

图7　各组小鼠VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平

图8　各组小鼠caspase-3活性水平

3　讨论

随着病程进展，肝纤维化常并发门静脉高压致上消化道出血，甚至有演变为肝癌可能。虽然目前对肝硬化门静脉高压并发食管胃底静脉曲张破裂出血及肝癌均能采用介入治疗，但对肝硬化尚无特殊介入治疗方法。氧化应激被认为是肝损伤的一个重要因素，氧化应激亢进和抗氧化机制破坏，最终导致肝损伤［15］。ROS超载使细胞DNA受损，质膜和胞内重要的酶蛋白氧化，导致细胞发生坏死或凋亡，如果受损DNA不能得到及时修复，会诱发突变致正常细胞癌变［16］。正常细胞和肿瘤细胞在新陈代谢中产生内源性ROS，且能维持相对平衡。细胞内存在的还原类物质GSH和SOD可主动清除积累ROS［17］。正常情况下肝组织主要表达内皮型一氧化氮合酶（eNOS），iNOS无或仅有少量表达。iNOS在肝组织受到内毒素（脂多糖）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）-lP等细胞因子刺激后表达增加，活性可持续较长时间，催化一氧化氮（NO）大量持续产生，介导广泛的毒性作用［18］。在氧化应激造成肝损伤中，iNOS表达与肝细胞坏死程度有关［19］。本研究表明，EA能抑制肝硬化小鼠iNOS蛋白表达，逆转GSH-PX、GSH、SOD、MDA活性并抑制ROS形成。

VEGF诱导血管内皮细胞增殖，在调节血管生成中具有重要作用［20］。近年研究表明，VEGF可诱导肝脏血管生成，促进损伤肝细胞再生，同时因有强烈的微血管通透性，促进急性炎性改变，引起血浆蛋白（包括纤维蛋白原）外渗并可凝集于血管外基质，形成纤维蛋白，促进肝硬化进展［21-22］。但仍有实验证明，肝硬化小鼠肝部分切除术后，VEGF能积极促进肝再生［23-25］。本研究提示，EA能明显抑制肝硬化小鼠VEGF、VEGFR-2蛋白表达。

Caspase-3是caspases家族成员之一，是细胞凋亡途径末端底物酶解的关键效应蛋白酶，其被激活后将引起细胞凋亡［26］。caspase-3表达水平可代表机体组织细胞的凋亡水平［27-28］。本研究结果表明，EA显著降低肝硬化小鼠中caspase-3活性。

EA对肝脏有保护作用，可抑制血清中ALT、AST、ALB水平和Ⅰ型胶原基因在肝硬化小鼠的表达。这些保护作用与抗氧化机制相关，即通过调节iNOS、VEGF和caspase-3表达，减少氧化应激反应发生，增加抗氧化酶而发挥作用；表明EA可能是一个潜在的新型药物，可在急性低氧条件下通过iNOS、VEGF和caspase-3表达缓解肝硬化、保护肝脏。本研究是EA对肝硬化作用的基础研究，未来将进一步开展经肝动脉插管灌注EA对肝硬化保护作用的动物试验研究［28］，为采用介入手术方式缓解肝硬化病程进展提供理论依据。

［参 考 文 献］

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