指纹图谱技术结合指标成分测定法监控颗粒剂制备

杨晓莹,窦桃艳,潘成成,吕延英,陈园园,贺怀贞,卢　闻

(1.西安交通大学 医学部， 陕西 西安　710061;2.西安世纪盛康药业有限公司, 陕西 西安　710300)

中药色谱指纹图谱技术是一种有效、常用的中药制剂质量研究技术[1-2],目前主要用于评价中药材及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性等方面。近年来,中药指纹图谱技术也广泛应用于中药制剂制备工艺的控制和评价[3-4],通过对制备过程中各中间体的指标成分定性、定量分析从而呈现出物质群在整个工艺过程中的变化情况,是一种可行的中药生产过程质量控制模式[5]。肾康注射液是目前临床应用广泛、治疗慢性肾衰竭的中药注射剂[6],为扩大产品品种,适应市场需求,研制了肾康颗粒。本研究选取肾康颗粒中的有效成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、丹酚酸B、羟基红花黄色素A(HYSA)和毛蕊异黄酮葡萄糖苷等8个成分作为主要指标成分[7],通过指纹图谱技术对物质群的定性分析和指标成分在肾康颗粒制备工艺过程中各中间体中含量的变化,建立制备工艺过程控制的方法[8]。这种采用指纹图谱技术与多指标成分定量相结合的综合评价方法可以有效地评价制剂制备工艺的合理性,同时控制从原药材到制剂的质量,为中药制剂生产的过程控制和保障药效发挥提供基础保障[9-10]。

1　仪器和试剂

1.1　仪　器

高效液相色谱仪(LC-2010 HT,SHIMADZU,Japan);DAD(SPD-M20A);控制器(SBM-20A);LC Solution 色谱工作站(岛津国际贸易有限公司);真空干燥箱(DAF-6020,巩义市英峪予华仪器厂);旋转蒸发器(RE-52A,上海亚荣生化仪器厂)。

1.2　试　药

芦荟大黄素(批号 110795-201308)，大黄酸(批号 110757-200206)，大黄素(批号 110756-200110)，大黄酚(批号 110796-201319)，大黄素甲醚(批号 110758-201415)，HYSA(批号 111637-201308)，丹酚酸B(批号 111562-201313)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号 110756-200110)均购自中国食品药品检定研究院;单味药材、肾康颗粒中间体(水煎液、醇沉液、水沉液)和肾康颗粒均由西安世纪盛康药业有限公司提供;乙腈、甲酸均为色谱纯,其余试剂均为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2　方　法

2.1　溶液的制备

2.1.1混合标准溶液的制备精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、HYSA、丹酚酸B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品于量瓶中,加甲醇溶解、稀释并定容至刻度,制成浓度分别为72.0，112.0，106.0，10.7，29.4，9.9，11.6，41.2 μg/mL的混合标准溶液。

2.1.2药材供试品溶液的制备肾康颗粒中四味药材大黄、丹参、红花和黄芪的供试品溶液制备方法参照《中华人民共和国药典2015年版》中药材项下含量测定的样品制备方法[11]。

2.1.3肾康颗粒各中间体和肾康颗粒供试品溶液的制备肾康颗粒剂中间体包括水煎液、醇沉液、水沉液,其中水煎液和醇沉液分为A组和B组。A组为大黄和丹参合煎液,B组为黄芪和红花合煎液;将A，B两组水煎液分别经过醇沉处理分别得到A，B组醇沉液;水沉液是合并两组醇沉液进行水沉处理;根据各中间体的得率,按处方药味组成折算水煎液、醇沉液、水沉液和颗粒的取样量,其供试品溶液的制备方法如下。

精密称取A组水煎液样品约1.80 g,醇沉液样品约0.59 g;B组水煎液样品约2.34 g,醇沉液样品约0.71 g;水沉浸膏约1.24 g;肾康颗粒约4.70 g,分别精密加入70%甲醇30 mL,称定重量,浸泡1 h,超声提取20 min(功率200 W,频率40 kHz),放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20 mL,挥去溶剂,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得水煎液、醇沉液、水沉液以及肾康颗粒供试品溶液。

2.2　肾康颗粒HPLC-DAD色谱条件的建立

以Welchrom-C18液相色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)为固定相;乙腈(A)和0.1%甲酸溶液(B)为流动相梯度洗脱,洗脱程序如表1所示;进样量:10 μL;检测波长为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和毛蕊异黄酮葡萄糖苷均为254 nm,丹酚酸B为288 nm,HYSA为403 nm。

表1　梯度洗脱程序Tab.1　Gradient elution program

2.3　定性分析

将药材供试品溶液、肾康颗粒各中间体供试品溶液、肾康颗粒剂供试品溶液分别进高效液相色谱仪分析,记录各检测波长下的色谱图。根据制备工艺,将大黄和丹参药材、A组各中间体及颗粒的HPLC-DAD指纹图谱在254 nm和288 nm下进行多波长融合,将红花和黄芪药材、B组各中间体及颗粒的指纹图谱在254 nm和403 nm下进行多波长融合,导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版,以药材的融合指纹图谱作为参照图谱,中位数法生成对照指纹图谱(图谱中标记为R),计算各指纹图谱与对照指纹图谱的相似度,并对共有峰进行匹配和定性分析。

2.4　定量分析

将肾康颗粒各中间体供试品溶液进高效液相色谱仪分析,计算相当于1 g处方生药的各中间体中8个指标成分的含量。

3　结　果

3.1　混合对照品溶液的HPLC-DAD融合色谱图

将混合对照品溶液的HPLC-DAD色谱图在254 nm，288 nm和403 nm下进行多波长融合,得到可以同时显示8个指标成分的对照品溶液的融合色谱图，如图1所示。

1 HYSA；2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷；3 丹酚酸B; 4 芦荟大黄素;5 大黄酸;6 大黄素;7 大黄酚;8 大黄素甲醚图1　混合对照品溶液的HPLC-DAD指纹图谱Fig.1　HPLC-DAD fingerprint of mixed reference solution

3.2　指纹图谱定性分析结果

3.2.1大黄和丹参的融合指纹图谱分析大黄和丹参药材的融合指纹图谱与各中间体的融合指纹图谱共匹配得到21个共有峰(图2),可作为肾康颗粒制备过程中对大黄、丹参物质组成监测的定性指标。通过与混合对照品溶液的融合色谱图对比确定峰12,15,17,18,19,21分别为丹酚酸B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。表2为肾康颗粒各中间体指纹图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果,水煎液、醇沉液、水沉液、颗粒与药材的相似度值从0.88递减到0.76,随着处理步骤的增加,各中间体和颗粒与药材的相似度降低;醇沉液、水沉液和颗粒与水煎液的相似度值均高于0.90,表明后续的工艺最大化的保持了水煎液中大黄、丹参的物质组成。

3.2.2黄芪和红花的融合指纹图谱分析图3为红花和黄芪药材的融合指纹图谱和各中间体的融合指纹图谱叠加图,共匹配得到27个共有峰,可作为肾康颗粒制备过程中对黄芪、红花物质组成监测的定性指标。与混合对照品溶液的融合色谱图比对确定峰1为HYSA,峰3为毛蕊异黄酮葡萄糖苷;药材及各中间体的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果见表3,药材与各中间体相似度较高,与颗粒相似度接近0.80,各中间体与颗粒的相似度均大于0.90,表明共有峰能够反映肾康颗粒各工艺所得中间体和成品的黄芪、红花药味的物质组成。

3.3　定量分析结果

相当于处方生药1 g的水煎液、醇沉液、水沉液和颗粒中的各指标成分的含量计算结果见表4,可知,丹酚酸B和毛蕊异黄酮葡萄糖苷经醇沉过程后,含量略有降低;大黄素经水沉工艺后,含量降低;而水沉液和颗粒中指标成分的含量差别较小,8个指标成分能够反映肾康颗粒处方药味经不同工艺处理后,代表性成分的含量变化,可用于监测各中间体的质量变化情况。

S1 药材;S2 A组水煎液；S3 A组醇沉液；S4 水沉液；S5 颗粒12 丹酚酸B；15 芦荟大黄素；17 大黄酸；18 大黄素；19 大黄酚；21 大黄素甲醚图2　大黄和丹参药材及肾康颗粒各中间体的HPLC-DAD融合指纹图谱叠加图Fig.2　HPLC-DAD multi-wavelength fusion fingerprints of rhubarb, salviaemiltiorrhizae and intermediates of Shenkang granules

Tab.2The similarity between the fusion fingerprints and the control fingerprints of rhubarb, radix salviaemiltiorrhizae and intermediates of Shenkang granules

药材水煎醇沉水沉颗粒对照指纹药材1水煎08831醇沉084009761水沉0763091809731颗粒07550897093609751对照指纹082909120945095309891

S1 药材；S2 B组水煎液；S3 B组醇沉液；S4 水沉液；S5 颗粒1 HYSA；3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷图3　红花和黄芪药材及肾康颗粒各中间体的HPLC-DAD融合指纹图谱叠加图Fig.3　HPLC-DAD multi-wavelength fusion fingerprints of radix astragali, safflower and intermediates of Shenkang granules

Tab.3The similarity between the fusion fingerprints and the control fingerprints of safflower, radix astragaliandintermediates of Shenkang granules

药材水煎醇沉水沉颗粒对照指纹药材1水煎08321醇沉082909661水沉0805093109501颗粒07800905093509941对照指纹081309080925097509821

表4　肾康颗粒制备中间体中的指标成分含量(n=3,×10-2 mg/g)Tab.4　The content of index components in the intermediates of Shenkang granules(n=3，×10-2 mg/g)

4　讨　论

本研究采用中药指纹图谱技术结合指标成分定量方法,旨在建立能监测肾康颗粒制备过程的质控方法。通过将同一样品不同波长的指纹图谱进行融合从而得到可同时体现3个波长、8个指标成分信息的肾康颗粒剂各中间体的指纹图谱,全面直观地反映制备过程中有效物质群在各中间体中的变化,避免采用单一波长单一指标成分评价制剂制备过程而导致的代表性不足;同时结合指标成分定量法测定8个指标成分在各中间体中的含量,这种定性定量分析相结合的研究方法可以系统地监控肾康颗粒剂的制备过程,便于有效地控制从原药材到制剂制备过程中的质量,同时利于优化制备工艺[12],可作为中药制剂生产过程的质量控制方法。

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