丁酸对新生儿坏死性小肠结肠炎新生小鼠模型的保护作用

李秋平，余加林，胡坤，贺雨，肖洒，侯婷，艾青

新生儿坏死性小肠结肠炎(neonatal necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿期常见且极为严重的胃肠道急症，在出生体重低于1500g的早产儿中发病率达7%，病死率可达20%～30%[1]。病情较重者须手术切除坏死肠组织，但术后常常发生短肠综合征等后遗症。目前研究认为菌群定植紊乱、肠黏膜免疫应激性增高等都是NEC的发病危险因素[2]。肠道菌群的异常定植与NEC的发生有着密切关系。而肠道细菌又往往是通过其代谢产物来影响机体功能的。短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)是细菌分解寡糖的产物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。丁酸是SCFA的代表，本研究以丁酸作为干预剂，建立NEC小鼠动物模型，探讨丁酸在NEC新生鼠模型中的保护作用，并分析其可能的作用机制，为NEC的治疗提供新的认识。

1 材料与方法

1.1 主要材料 60只清洁级新生3d的C57BL/6新生小鼠，雌雄不限，体重1.5～3.0g(重庆医科大学动物中心，中国)。雅培婴幼儿奶粉(雅培公司，美国)，贝克幼犬奶粉(贝克公司，美国)，组织及细胞裂解液(RayBiotech公司，美国)，红细胞裂解液(天根公司，中国)，丁酸钠(上海生物工程公司股份有限公司，中国)，HBSS平衡盐溶液(Gibco公司，美国)，胶原酶、DNA酶(Sigma-Aldrich公司，美国)，PMSF蛋白酶抑制剂混合物(碧云天公司，中国)。组织RNA提取试剂盒(Qiagen公司，德国)，反转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)，IL-10、TGF-β1ELISA检测试剂(北京四正柏生物科技有限公司，中国)，Permeabilization Buffer 10X(eBioscience公司，美国)，流式抗体CD3 (clone 500A2)、CD4(clone GK1.5)、FOXP3(clone FJK-16S)(BD公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组和处理 60只3日龄C57BL/6新生小鼠按照随机数字表法分成丁酸组和PBS组(n=30)。丁酸钠(上海生物工程公司股份有限公司)配置成150mmol/L的溶液，调节pH至中性(pH 7.0)[3]。 生后第3天开始连续7d予以PBS、丁酸灌胃，再连续3d建立新生鼠NEC模型。具体建模方法：10日龄的C57BL/6新生小鼠放置在自制保育箱内，控制保育箱内温度36±1℃，湿度45%～60%。根据文献报道配制代乳品，经口插入PICC管灌胃喂养。喂养量为0.03～0.05ml/g，每4h喂养1次[4]。将新生鼠放入自制的缺氧箱内，向箱内充入纯氮(100% N2)，控制N2流量为10L当测氧仪/min，测得箱内O2浓度降为零时开始计时，1min后关闭阀门并将新生鼠取出。5min后立即将其置于4℃冰箱中刺激10min。缺氧、冷刺激每日2次。

1.2.2 新生鼠一般状况 观察新生鼠有无腹胀、腹泻及血便，活动是否良好等情况。

1.2.3 新生鼠肠组织大体形态 两组小鼠NEC建模后隔夜处死，取出十二指肠下端至回盲部肠管，肉眼观察有无肠腔积气、出血、坏死等NEC样病变。取小鼠近回盲部1～2cm肠组织，立即将其固定于4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋、切片、HE染色、封片，光学显微镜下观察肠组织病理学变化。参照Dvorak等[5]报道的标准，采用双盲法进行肠组织损伤评分，评分≥2分确定为NEC。每例组织标本观察3个视野，取其平均值。

1.2.4 实时荧光定量qPCR检测IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1水平 从–80℃取出冻存的肠组织，提取总RNA，所有步骤严格按照RNA提取试剂盒(Qiagen公司，德国)说明书操作。Nanodrop 2000测定每个样本RNA浓度，按照反转录试剂盒(TaKaRa，日本)进行操作将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，在Bio-Rad CFX90 Real-time PCR仪上进行扩增IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1。RT-PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、56℃退火5s、65℃延伸5s，共39个循环。采用 2–ΔΔCt(ΔCt=目的基因Ct值－内参Ct值)进行目的基因相对表达量分析，以GAPDH为内参照。GAPDH，上游引物：5'-TGCCCCCATGTTTGTGATG-3'，下游引物：5'-TGTGGTCATGAGCCCTTCC-3'，片段 大小151bp；IL-6，上游引物：5'-ACAACCACGGC CTTCCCTACTT-3'，下游引物：5'-CACGATTTCC CAGAGAACATGTG-3'，片段大小129bp；IL-10，上游引物：5'-GCCGTCATTTTCTGCCTCAT-3'，下游引物：5'-GCTTCCCTATGGCCCTCATT-3'，片段大小131bp；TNF-α，上游引物：5'-ATGGCCTCCC TCTCATCAGTT-3'，下游引物：5'-ACAGGCTTGT CACTCGAATTTTG-3'，片段大小80bp；TGF-β1，上游引物：5'-CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3'，下游引物：5'-GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3'，片段大小133bp。

1.2.5 ELISA检测肠组织IL-10、TGF-β1蛋白表达水平 从–80℃冰箱取出冻存的肠组织，按照20mg加入100μl组织裂解液的比例加入组织裂解液，同时加入相应体积的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)，组织匀浆，4℃、14 000×g离心10min，取上清液，保存于–20℃。采用酶联免疫吸附试验测定IL-10、TGF-β1水平，严格按照试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)说明书操作。

1.2.6 小鼠肠道黏膜固有层淋巴细胞(intestinal lamina propria lymphocytes，LPL)分离及流式细胞仪检测肠道固有层Treg数量 取小鼠肠组织标本，加入HBSS平衡液及消化液得到LPL，总体积保证每个上样管细胞数约为1×106个，加入表染抗体2μl，孵育20min；PBS洗涤2次，加入400μl固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，旋涡混匀，避光4℃孵育45min，加入1ml缓冲液(Permeabilization Buffer)洗涤2次，加入细胞内染色抗体2μl，避光4℃孵育45min，加入1ml缓冲液(Permeabilization Buffer)洗涤2次，200μl PBS重悬细胞，于BD FACSCanto Ⅱ仪器上机检测并分析。小鼠肠固有层Treg细胞流式标记法：CD3-PB、CD4-FITC、Foxp3-PE。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism software version 6作图，流式图采用FlowJo-V10，并采用SPSS 22.0统计软件进行分析。对定量资料进行正态性分布检验，符合正态分布且方差齐的计量资料采用±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；正态方差不齐的计量资料采用中位数M(Q)表示，正态方差不齐组间比较采用Wilcoxon Mann-Whitney检验。生存分析采用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验。P<0.05为差异有统计学意义。

图1 两组小鼠体重及生存分析Fig.1 Weight and survival analysis of two groups

2 结 果

2.1 新生鼠体重变化及生存情况 由图1所示，建模第1、2、3天，两组体重差异无统计学意义。取标本时，丁酸组体重(4.50±0.42g)明显高于PBS组(4.16±0.60g)，差异有统计学意义(P<0.05)；而丁酸组生存率(76.34%)与PBS组(67.95%)比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肠组织大体形态、病理学形态及病理损伤评分 肉眼观察显示，丁酸组稍有积气及水肿，无出血(图2A)；PBS组新生鼠肠组织肠腔有积气，部分有串珠样改变(图2B)。光镜下观察可见，丁酸组绒毛相对完整，肌层较厚(图2C)；PBS组绒毛变性水肿，部分绒毛坏死、脱落或消失，肌层变薄甚至断裂(图2D)。光镜下肠组织病理损伤评分结果显示，丁酸组肠组织损伤评分中位数为1.33(1.33～1.67)，明显低于PBS组2.00(1.67～2.25，P<0.05)。

2.3 qPCR检测IL-6、IL-10、TNF-α及TGF-β1基因水平 与PBS组相比，丁酸组肠组织IL-6 mRNA(0.85±0.30 vs.1.77±0.49，P<0.05)及TNF-α mRNA(0.41±0.25 vs.0.96±0.56，P<0.05)表达水平明显降低，而IL-10 mRNA(1.91±0.82 vs.0.94±0.43，P<0.05)及TGF-β1mRNA(1.46±0.57 vs.0.88±0.29，P<0.05)表达水平明显升高(图3)。

2.4 ELISA检测小鼠肠组织炎症抑制因子IL-10、TGF-β1水平 与PBS组相比，丁酸组肠组织IL-10蛋白表达水平(68.60±15.06 vs.37.25±5.81)及TGF-β1蛋白表达水平(424.93±19.34 vs.127.31±60.83)明显升高(P<0.05，图4)。

2.5 肠道固有层Treg数量百分比的比较 流式细胞仪检测结果显示，丁酸组Treg细胞所占百分比(12.68%±6.79%)明显高于PBS组(3.57%±0.88%)，差异有统计学意义(P<0.05，图5)。

图2 两组肠组织肉眼及病理形态学观察Fig.2 Visual and histopathological observation of intestinal tissue in two groups

图3 两组IL-6、IL-10、TGF-β1及TNF-α mRNA表达水平比较(qPCR)Fig.3 Expression of IL-6, IL-10, TGF-β1 and TNF-α mRNA in two groups (qPCR)

图4 两组IL-10、TGF-β1蛋白表达水平比较(ELISA)Fig.4 Expression of IL-10, TGF-β1 protein in two groups (ELISA)

图5 两组肠道固有层Treg细胞表达数量的比较Fig.5 Expressed number of Treg cells in gut lamina propria in two groups

3 讨 论

NEC是新生儿病房中常见的危重症，但其发病机制尚不清楚。目前研究认为肠道功能不成熟、肠血流灌注失衡、异常肠道菌群定植、感染等都是NEC的发病危险因素[6]。目前普遍认为NEC的发生与肠道菌群相关。Warner等[7]报道发现，与对照组相比，NEC患儿肠道菌群中变形菌门比例明显增加，而厚壁菌门比例则明显下降。而且肠道菌群定植的异常也会引起代谢产物发生相应变化。丁酸主要是由肠道中厚壁菌门、拟杆菌门代谢产生[8]，是肠上皮细胞最重要的能量来源，还可以促进干细胞增殖，增加隐窝深度和小肠绒毛长度，促进分泌性黏蛋白增多[9-10]。丁酸促进肠上皮细胞(IESs)间的紧密连接，降低肠道通透性，减少有害物质(如脂多糖LPS)入血，减少促炎因子的生成[11]。给无菌小鼠饮用含有丁酸钠的水可以增加小鼠肠黏膜固有层的Treg细胞数量，并且增强Treg细胞对炎症抑制因子IL-10的合成[12]。本实验表明，丁酸组小鼠在体重、生存情况、肠道大体形态及肠组织病理学损伤等方面均明显好于正常对照组。可能的原因为：丁酸是一种弱酸(pH=4.8)，通过简单扩散、逆转运及载体转运进入肠上皮细胞发挥作用[13]；丁酸对组蛋白去乙酰化酶的抑制作用可以激活肠上皮细胞中的转录因子活化蛋白-1(AP-1)信号通路，从而抑制促炎因子IL-6、TNF-α等炎症因子的释放，从而起到抗炎作用[14]；丁酸对组蛋白去乙酰化酶的抑制作用还可以促进Treg细胞的增殖活化，促进Treg细胞相关的IL-10、TGF-β1抗炎因子的表达升高，从而发挥其抑制炎症反应的作用。Treg细胞是一种具有免疫抑制作用的CD4+辅助性T细胞亚群，其通过抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化来发挥免疫抑制作用。qPCR结果显示，与PBS组相比，丁酸组炎症因子IL-6、TNF-α表达降低，IL-10、TGF-β1抑炎因子表达水平升高。ELISA结果显示，丁酸组IL-10、TGF-β1蛋白水平表达明显高于PBS组。流式结果显示丁酸组Treg细胞占CD4+T细胞比例较PBS组高，提示丁酸促进了CD4+T细胞向Treg细胞的分化。

综上所述，丁酸是重要的肠道微生物发酵产物，具有促进生长、增强机体免疫力、调节肠道微生物等功能，对维持肠道乃至机体的免疫平衡有着重要的作用。本实验成功建立了NEC动物模型；检测了Treg细胞数量及IL-10、TGF-β1、IL-6、TNF-α表达水平，结果发现丁酸可通过促进Treg细胞的分化以及与Treg细胞相关的IL-10、TGF-β1的表达升高，从而发挥其抑制炎症反应的作用。目前针对丁酸生理作用的具体机制的研究还不完善，有关丁酸对生理调节作用的研究多为幼畜，且缺乏大规模临床试验的报道。本研究中丁酸对炎症的抑制作用以及对肠黏膜的保护作用为临床NEC患儿的治疗提供了新的途径。目前关于丁酸结合具体的动物模型或临床试验的研究未见大量报道，因此尚须进行大量动物和临床研究以进一步证实其作用及机制。

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