电针深刺对三叉神经痛大鼠三叉神经节中P2Y2受体及Kv3.4表达的影响

2018-04-16李崖雪高瑞雪李晓陵闫禹竹王欣波孙士红任佰亮

长春中医药大学学报 2018年2期

李崖雪，高瑞雪，刘潇*，王丰，李晓陵，闫禹竹，王欣波，孙士红，任佰亮

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

原发性三叉神经痛(TN)是最痛苦、难治疾病之一，发病率接近 4.5/100 000，老年女性多发[1-2]。目前，中枢病因学说认为TN的发病为癫痫样改变，周围学说认为是该神经脱髓鞘改变[3]。在三叉神经节神经元中存在P2Y2 受体，激活P2Y2受体通过抑制Kv通道亚型表达增强TG神经元兴奋性，引起大鼠颜面病理性疼痛[4]，本研究通过运用电针配合深刺下关穴方法降低大鼠三叉神经节神经元中P2Y2受体表达情况并增加Kv3.4 mRNA表达而达到止痛目的。

1 材料与方法

1.1 动物 SD成年雄性大鼠，体质量（250±50）g由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 主要仪器与试剂 5-0可吸收铬肠线（上海医疗器械有限公司），小鼠来源的大鼠β-actin单克隆抗体（Cell signal technique公司），多克隆兔抗大鼠P2Y2（Santa Cruz 公司）；E831型电泳仪（Consort公司比利时），Western Blot转膜系统及垂直电泳(Bio-Rad公司美国），羊抗大鼠Kv3.4（Santa Cruz公司），PTPCR仪（CORBETTRESEARCH澳大利亚公司)。

1.3 模型制备对SD大鼠进行腹腔麻醉后俯卧位固定，局部消毒，镜下做右眉弓上弧形切口，暴露出眼眶，拨开内容物，暴露出眶下神经，从近向远分离眶下神经。用2根铬线结扎神经，间距2 mm。压迫力度：纤维镜下可见神经略微变细，不全阻断神经传导，保持神经外膜血液通畅。待动物醒后进行观察（通常于术后14 d成模），模型成功率70%。

1.4 模型成立标准 14 d后操作员持刺激棒对大鼠患侧面部进行刺激，如出现：大鼠患侧面部避免被接触，快速后退，或表现将头面藏于身下，躲避刺激或团起身子向笼壁靠拢，大鼠快速抓咬刺激物的攻击行为，非对称性面部搔抓至少连续3次中的任意1项或l项以上即模型成立。

1.5 分组及治疗方法选用成年雄性SD大鼠30只，随机分为3组，各10只。电针组（电针配合深刺下关穴治疗组）：14 d后（模型成立）即开始对大鼠治疗，采用不锈钢毫针，规格：0.18 mm×13 mm（上海真康医疗公司）；右侧下关穴进行直刺，深度约5 mm（尽量接近三叉神经半月节处），向后平刺百会穴，深度约3 mm；连接电针治疗仪，正极连接百会穴，负极连接下关穴，选择波形：输出频率80 Hz/s连续波，电针20 min，再留针10 min后拔针，2次/d，14 d为1疗程。假手术组：切开皮肤暴露神经，不结扎神经，缝合右侧眶部皮肤后观察。模型组：切开皮肤暴露神经，结扎神经，制备大鼠TN模型。

1.6 痛阈测定用BME-403型细丝法检测仪从小到大逐渐增加折力，对大鼠触须及周围皮肤进行刺激，各强度需要刺激6次，取平均值确定大鼠痛阈。当强度大于20.1g时，大鼠未出现疼痛反应，痛阈即可以定为20.1g。对各组大鼠痛阈进行统计比较。

1.7 Western Blot方法检测P2Y2受体用PBS洗涤培养后的三叉神经半月节,加入细胞裂解液，进行裂解细胞，刮下细胞后，收集于微量离心管中，5～10 min沸水浴， 12 000 r/min离心10 min。取上清，测定蛋白含量（Bradford法）。样品每种取蛋白50 μg，加入上样缓冲液后进行不连续SDS-PAGE（浓缩胶60g/L，分离胶100g/L）。泳毕，把蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，滴加BSA（10 g/L）封闭，依次滴加一抗（多克隆兔抗大鼠P2Y2 ，浓度1:1 000）及二抗（标记的羊抗兔IgG，1:3 000 HRP），室温下分别作用1、2 h。然后进行洗膜，之后用化学发光法ECL进行检测，程序为将X线片先显影2～20 min，进行定影，再通过图像分析软件Image tool读取在X线胶片上测得目的条带的光密度值，然后检测β-actin条带的光密度值，以此做参考标化各组P2Y2蛋白表达量。

1.8 实时定量PCR检测Kv3.4 mRNA表达情况提取三叉神经节RNA，取总RNA 1 μg为模板，以β-actin做为内参，进行检测。扩增条件：先95 ℃预变性，然后持续5 min进入30个循环，72 ℃7 min延伸；β-actin扩增条件：先95 ℃预变性，在4 min后进行32个循环，10 min 72 ℃延伸。扩增产物进行电泳。采用凝胶成像系统对目的电泳条带进行读取，将3组Kv3.4的灰度值标化，进行比较。

1.9 统计学方法用SPSS 17. 0统计分析，数据用均数±标准差（）表示，各组数据比较采用方差分析，P＜0.05为有差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组痛阈比较见表1。

表 1 3组痛阈比较（，n = 10）

注：与模型组比较，# P＜0.05

组别术后14 d 术后28 d假手术组 10.22±3.46 # 11.56±2.36#针刺组 1.46±0.25 10.36±2.88#模型组 1.02±0.04 3.44 ±1.65

2.2 3组大鼠三叉神经节神经元P2Y2受体蛋白表达情况模型成立后（术后14 d），假手术后14 d及电针深刺治疗14 d（术后28 d）后，Western blot方法测定大鼠三叉神经节中 P2Y2受体的表达。经电针深刺法治疗后三叉神经痛大鼠TG中P2Y2受体的表达显著下降，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 3组大鼠三叉神经节中 Kv3.4 mRNA的表达情况模型成立后（术后14 d），假手术后14 d及电针深刺治疗14 d（术后28 d）后，采用实时定量PCR测定大鼠三叉神经节中 Kv3.4 mRNA的表达。经电针深刺法治疗后三叉神经痛大鼠TG中Kv3.4 mRNA表达显著增加，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

三叉神经痛，针灸选穴上常以局部选穴为主或按分支选穴[5]，存在诱发三叉神经痛发作的弊端[6]，本研究颜面只取一个远离疼痛部位的下关穴[7]，与总督一身阳气的百会穴[8]相配，既不会诱发疼痛又起到疏调颜面阳经经气作用，达到经脉通则不痛的目的。配合电针波形中密波以充分达到镇痛作用[9-10]。

同时下关穴深刺尽量接近三叉神经半月节，在三叉神经节神经元中存在P2Y2受体。 P2Y2受体在体内广泛分布，激活后具有显著病理生理效应[11]。P2Y2受体下调（可以通过该受体抑制剂）对传递疼痛信号起到抑制作用，从而终止疼痛[12]。而三叉神经痛发病机制正是由于某种损伤激活TG上P2Y2受体，进而抑制Kv通道亚型表达增强TG神经元兴奋性，引起大鼠颜面病理性疼痛[4]。本研究通过运用电针配合深刺[13]下关穴方法尽量接近并刺激大鼠三叉神经节，降低大鼠三叉神经节神经元中P2Y2受体表达情况。同时电压门控性钾通道亦受到TG上P2Y2受体的调节，进一步促使神经末梢中神经递质释放[14]。通过研究，在TN发作时IA起作用最明，IA的Kv通道亚型主要是Kv3.4等。本实验结果显示，电针深刺法治疗后三叉神经痛大鼠疼痛程度明显减轻，TG中P2Y2受体的表达显著下降、Kv3.4 mRNA表达显著增加，与模型组比较，P＜0.05，与假手术组比较，P＞0.05。结论：此法可以通过降低P2Y2受体表达同时增加Kv3.4 mRNA表达，抑制神经元兴奋性而起到镇痛作用。

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