沙拉沙星及与安普霉素联用的体外抗菌后效应研究

全岩

（辽宁省盖州市动物疫病预防控制中心，辽宁盖州115000）

沙拉沙星是一种动物专用的氟喹诺酮类的药物。被广泛应用于防治禽类的大肠杆菌病，同时也被开发并应用于水产行业。安普霉素临床上也主要用治疗大肠杆菌等引发的感染性疾病，为了合理应用抗菌药，制定合理的给药方案，本文对沙拉沙星及与安普霉素联用的PAE进行了研究。

1 试验材料

1.1 抗菌药物

盐酸沙拉沙星：含量98%，批号98105-99-8，郑州艾克姆化工有限公司

安普霉素：含量99%，批号37321-09-8，天津康泰生物科技有限公司

1.2 生物/化学试剂

生理盐水：无菌生理盐水

牛肉膏：BR，北京弘润宝顺生物科技有限公司，批号68990-09-0

可溶性淀粉：AR，北京康普维科技有限公司，批号9005-8-49

酪蛋白酸性水解物：河南盛之德商贸有限公司，批号9005-40-3

1.3 试验菌种

大肠杆菌（吉林农业科技学院实验室提供）、金黄色葡萄球菌（吉林农业科技学院实验室提供）

1.4 仪器设备

电子天平∶德国Sartorius，感应量万分之一。微量加样器∶100～1000μL，长沙科怡仪器设备有限公司。超净工作台，恒温培养箱，高压灭菌锅，电冰箱等。

2 试验方法

2.1 培养基的制备

MH培养液：称取牛肉粉5g，酪蛋白酸性水解物17.5g，可溶性淀粉0.15g。加热溶解后，加蒸馏水至1000mL，调终pH至7.2～7.4，于121℃下高压灭菌15min备用。

2.2 抗菌药物贮存液的制备

精确称取一定量的沙拉沙星和安普霉素粉剂，分别置于50mL容量瓶中，用超纯水充分溶解并定容，使药液的终浓度为1280μg/mL，此为贮存液。置于冰箱中-20℃低温保存，使用前需用无菌生理盐水稀释成所需浓度，高压灭菌后置于冰箱在温度为4℃条件下储存备用。

2.3 药物体外抗菌活性的测定

采用试管液体二倍稀释法[1]来分别测定两种药对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)，并将其过程重复3次，取平均值。

2.3.1 实验前准备工作：实验中所用到的玻璃仪器均需在高压灭菌锅中灭菌。在高压灭菌锅中取出15支试管放在试管架上，标号1-15。

2.3.2 实验过程：用已灭菌的移液管吸取0.9mL的MH培养液于1号试管中，剩余的14支试管中，每支都加入0.5mL培养液。然后再取一支新的移液管吸取抗菌药物原液0.1mL放于1号试管中，轻轻震荡摇匀，注意吸取不同的液体需更换移液管，以免引起污染。另取一支移液管从已混匀的1号试管中吸取0.5mL放在2号试管中，混匀后再吸取0.5mL放于3号试管中。如此连续倍比稀释至第13管，并从第13管中吸取0.5mL滴到营养琼脂平板上，进行无菌检查。这样，第1～13号试管的药液浓度分别 为 128μg/mL、 64μg/mL、 32μg/mL、 16μg/mL、 8μg/mL、4μg/mL 、2μg/mL 、1μg/mL 、0.5μg/mL 、0.25μg/mL、 0.125μg/mL、0.06μg/mL、0.03μg/mL。然后，在1号到14号每支试管中均加入已准备好的稀释菌液0.5mL并盖上棉塞。另设定最后两支试管为对照组，14号为只接种菌液的培养物对照，而15号为不加菌液和抗菌药的培养基对照。最后，将以上所有试管按标号顺序排好，与营养琼脂平板一起放入恒温培养箱，设置温度为37℃，培养18～24h，取出观察试管中的变化。

2.3.3 观察方法：当对照培养物发生浑浊时，观察1-13号试管哪只试管还澄清，则这只试管所对应的药物浓度就为该药的最小抑菌浓度（MIC）。

2.4 两种药物联用体外抗菌活性的测定

联合药敏试验是以两种药物的MIC为基础，在细胞培养板上以微量棋盘稀释法进行测定[2]。用MH培养液将安普霉素和沙拉沙星分别稀释到各药的 1/4MIC、1/2MIC、1MIC和 2MIC，用微量加样器吸取稀释好的安普霉素药液50μL按浓度由低到高的顺序按行加入到细胞培养板上，要注意同行的药物浓度需一致，每行加5孔；更换枪头以同样吸取方法吸取等量稀释好的沙拉沙星药液按列加入细胞培养板，同列的药物浓度也应该一致。另第1行作为不加安普霉素的沙拉沙星对照组而第1列作为不加沙拉沙星的安普霉素对照组；第1列和第1行各孔中分别加入浊度为 2×105CFU·mL-1的菌液 50μL，其余各孔中分别加入浊度为 2×105CFU·mL-1的菌液 100μL，使每孔菌液的终浊度为 1×105CFU·mL-1；将组合好的细胞培养板在37℃恒温培养箱中孵育18h，采用比浊法进行观测，记录两药联用时的MIC试验重复3次，结果取平均值。

2.5 体外PAE的测定

2.5.1 对数期生长菌液的制备

挑取待测菌1～2个单个菌落接种于2mL MH肉汤中，37℃孵育16～18h，以麦氏比浊管校正其浊度为108cfu/mL，用37℃预温的新鲜MH营养肉汤稀释100倍，使其浊度为106cfu/mL。

2.5.2 PAE诱导

用已灭菌的移液管分别吸取10MIC、20MIC、40MIC的沙拉沙星各0.2mL与1.8mL浊度为106cfu/mL的对数生长期菌悬液置于3支15mL试管中，作为实验管。另取一支试管作为空白对照，只加入1.8mL对数生长期菌液，以及0.2mL无菌生理盐水。轻轻振荡混匀上述四支试管，立即放于37℃恒温箱中培养1.5h，最终使各管药物浓度分别为1MIC、2MIC、4MIC、0MIC（空白对照组）。

2.5.3 药物的去除与重建

采用1000倍稀释法清除药物。取上述1MIC、2MIC、4MIC以及空白对照管中的菌液各0.1mL分别加入4支99.9mL在37℃的温度下预热的新鲜MH营养肉汤中进行重建，并存放于37℃恒温培养箱中进行培养，并将此时记为重建后的零时。

2.5.4 PAE测定

在上述培养条件下于不同时间：0.5、1、2、4、6、8、12、16、24h进行采样，用MH培养液对样品进行10倍系列稀释。在超净工作台上用微量加样器吸取0.1mL菌液放在MH琼脂平皿上，用接种环在平皿上轻轻划线（不要接触平皿边缘）于35℃～37℃培养18～20h，选择生长30～100个菌落的平皿，用菌落计数器计数，根据稀释度算出每mL菌液的活菌数。将细菌计数所得的各时间点的cfu/mL值取常用对数（lg）为纵坐标，以培养时间(h)为横坐标作图，建立实验菌与对照菌重建后恢复生长的动力学曲线[3]。

2.5.5 PAE计算

依据细菌重建后恢复生长的动力学曲线，计算出T、C，按照公式PAE=T-C来计算，其中T为实验组细菌的值高于重建后零时的10倍(1lgcfu/mL)所需要的时间(h)，C为对照组细菌的值高于重建后零时的10倍(1lgcfu/mL)所需要时间(h)[4]。

3 实验结果

3.1 体外抑菌实验结果

根据表3-1可知，沙拉沙星和安普霉素对两种菌都有较强的抗菌活性，其中沙拉沙星对大肠杆菌单用的MIC值为0.25，小于对金黄色葡萄球菌的MIC，这说明大肠杆菌对沙拉沙星的敏感性要优于金黄色葡萄球菌。而单用安普霉素对金黄色葡萄球菌的MIC为0.63，要小于对大肠杆菌的MIC，所以，金黄色葡萄球菌对安普霉素的敏感性优于大肠杆菌。根据表3-1还可以看出安普霉素与沙拉沙星联用MIC相对与单用的MIC都有所降低。

表3-1 沙拉沙星和安普霉素联用的MIC（μg/mL）（平均值）

3.2 细菌生长的动力学曲线

根据图3-1、3-2可以看出同一时间不同浓度的药物对于细菌的生长繁殖都具有抑制作用，随着药物浓度的增大对细菌的生长繁殖的抑制力越强，在前四小时药物对于细菌的生长抑制较明显，细菌生长曲线较平缓，而四小时之后细菌的生长缓慢恢复。对比3-1与3-2可以发现在两种药联用时，金葡萄球菌的恢复再生长的时间要早于大肠杆菌，这说明，沙拉沙星与安普霉素联合应用对大肠杆菌的抑菌效果要强于金葡萄球菌。

图3-1 金黄色葡萄球菌的生长曲线

图3-2 大肠杆菌的生长曲线

表3-2 沙拉沙星单用对两种菌体外PAE结果

表3-3 沙拉沙星与安普霉素联合用药的PAE结果

3.3 PAE测定结果

根据表3-2可知，沙拉沙星在1MIC～4MIC浓度范围内对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均存在体外PAE且时间有所差异。对比不同浓度药物对同一种菌的体外PAE可发现随着药物浓度的增加，体外PAE时间均有所延长，呈正相关。由表3-3对比可知，同一浓度沙拉沙星与安普霉素联用可有效延长PAE，不同浓度不同种菌类PAE程度有所不同。

4 讨论

4.1 在1MIC时，单用沙拉沙星对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的PAE分别为0.92±0.28h、1.15±0.31h，即沙拉沙星对上述细菌都有不同程度的PAE。而沙拉沙星与安普霉素联合应用在1MIC对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的PAE分别为1.68±0.26h，1.45±0.25h，相比较而言PAE延长。再者，两种药联用对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在药物浓度为2MIC和4MIC的PAE分别为 2.05±0.35h、2.13±0.27h 和 3.47±0.32h、2.47±0.34h。 从数据看出，PAE成明显的剂量依赖性，且大肠杆菌的PAE值最大。

4.2 本试验的结果显示，两种药物联用对G-（大肠杆菌）的体外PAE的时间比对G+（金黄色葡萄球菌）的体外PAE要长，这可能与沙拉沙星与安普霉素联用对G-的杀菌效果更好，给细菌造成了严重损伤，所以在清除药物后，细菌的生长繁殖能力恢复的比较缓慢。

5 结论

以试管二倍稀释法测MIC操作简便，准确可靠。本实验中样品处理方法采用的是1000倍稀释法，简便可靠，药物去除完全。沙拉沙星对大肠杆菌的MIC为0.25μg/mL，属于高度敏感；对金黄色葡萄球菌的MIC为1.0μg/mL，属于中度敏感；而安普霉素对与大肠杆菌的MIC为 2.5μg/mL属于中度敏感，对金黄色葡萄球菌的MIC为0.63μg/mL，属于高度敏感，所以这两种抗生素对这两种细菌均有较强的抗菌活性。沙拉沙星与安普霉素联合用药的体外PAE较单用沙拉沙星的体外PAE效果较明显，且PAE大小与药物浓度呈正相关，并推测其最佳接触时间为4h左右。

[1]刘明春.司帕沙星体外抗菌活性的试验[J].中国兽医科技,2003(5)：52-54.

[2]黄宝明.安普霉素及其联合用药对三种细菌PAE的研究[D].黑龙江八一农垦大学,2010.

[3]黄宝明,王新,崔一喆.安普霉素及其联合用药对大肠杆菌的PAE研究[J].黑龙江八一农垦大学学报.2009(06).

[4]徐叔云,卞如濂,陈修等.药理实验方法学（第二版）[M].北京：人民卫生出版社.2003,2003,37(10)：30-32.