肝炎及肝硬化患者血代谱及生物标记物相关性研究

徐　茜,张　晨

(陕西省西安市第九医院:1.检验科；2.感染性疾病科　710054 )

肝脏是人体内重要的代谢器官，具有解毒以及吞噬等重要功能[1-2]。人体胆汁的合成主要也是由肝脏细胞完成的，肝脏通过促进胆汁的合成与分泌进而促进人体对脂类的吸收。同时，肝脏与人体激素的分泌息息相关，人体内的多种激素在肝脏中分解或转化；当肝脏发生病变时，激素便失去活性，从而导致人体出现多种病症，人体的代谢过程也受到影响。代谢组学在临床医学方面的应用主要集中于疾病的发病机制、预后评估以及疾病的诊断治疗方面。由于原发性胆汁性肝硬化(PBC)与自身免疫性肝炎(AIH)在临床治疗方面都没有特定的典型性关系，因此，两种疾病经常会同时发生，对临床上的治疗造成了极大的困扰。本试验在正离子模式之下应用线性梯度超高效液相色谱飞行时间质谱对两种疾病患者的血清进行分析，寻找用于诊断AIH以及PBC的血清标志物，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2014年5月到2015年6月在本院治疗的确诊为AIH的患者42例作为AIH组，45例PBC患者作为PBC组，并选取50例健康体检者作为对照组。本试验所有研究对象均签署知情同意书。

1.2纳入及排除标准

1.2.1纳入标准[3]AIH诊断标准：2015年国际AIH小组制定的诊断评分标准[4]。PBC诊断标准：2015年美国肝病协会制定的关于诊断PBC的相关准则[5]。所有纳入研究的患者均已确诊为该病患者。

1.2.2排除标准(1)药物性肝炎、病毒性肝炎或酒精性肝患者；(2)艾滋病感染者；(3)同时患有原发性肝癌的患者；(4)患有甲状腺功能亢进或糖尿病等代谢疾病的患者。

1.3方法参与研究的研究对象需晨起空腹采集血清标本，在4 ℃下离心6 min左右，放在-80 ℃的恒温冰箱中保存。在正式试验的前1天将样品置于4 ℃下解冻，将血清标本与乙腈按照1∶3的比例均匀混合。在4 ℃下离心20 min，取450 L上层清液进行超高效液相色谱梯度分析[6]。液相色谱的柱温为35 ℃，色谱柱为ACQUITRC18柱，见表1。

表1　　超高效液相色谱梯度洗脱程序

注：正离子模式下A为水+0.1%甲酸，B为乙腈+20%异丙醇+0.1%甲酸；负离子模式下A为水+0.1%甲酸，B为甲醇+0.1%甲酸

1.4统计学处理采用SPSS20.0软件进行处理分析，对研究对象进行均衡性检验，组间比较采用单因素方差分析或独立t检验。采用有监督和无监督两种模式对数据进行分析，无监督模式是用线性投影法把多成新的主成分，有监督模式则是在已有分组中进行识别与归类通过载荷图以及得分图可以直观地观察分析结果。

2　结　　果

2.1AIH组与PBC组患者正负离子模式下变量书及谱峰比较所有的血清标本在经过超高效液相色谱-质谱分析之后，得出AIH组与PBC组患者在正负离子模式下谱峰差异有统计学意义(t=4.104，P<0.05)，见表2。

表2　　AIH组与PBC组患者正负离子模式下变量数及谱峰比较

2.2两种疾病诊断模型的建立对AIH组与PBC组的血清标本色谱-质谱数据进行分析，发现这两组正离子模式下与负离子模式下与对照组血清标本都可以明显分开。除此之外，在正离子模式下AIH组与PBC组患者数据的区分不明显，但在负离子模式下两组患者区分明显。为了更好地找到并鉴定潜在的生物标记物，又釆用了有监督的模式识别方法对标本数据进行了分析比较。结果发现在负离子模式下两组得到了很好的区分。负离子模式下模型的解释率和预测率为R2Y=0.991，Q2Y=0.943。对该模型进行交叉验证。

2.3生物标记物的鉴定保留时间、质量数与串联质谱数据是鉴定生物标志物的3条准则。首先，根据生物标志物的精确质荷比到数据库中对比査找可能物质，并购买可能性大的物质的标准品分析，在相同的色谱条件之下物质的保留时间相同，之后进行串联质谱分析，并将获得的生物标志物的二级质谱图与标准品的二级谱图比较，二者谱图如果完全匹配就能鉴定二者是同一物质。如标本血清中物质的谱图与溶血卵磷脂的图谱谱图完全匹配，则鉴定为溶血卵磷脂。本试验便是按照这3条准则对脂肪酸、胆汁酸、溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂5类20种生物标记物进行了鉴定分析。分析结果显示，AIH组与PBC组患者体内胆汁酸的水平高于对照组，差异有统计学意义(t=5.102，P<0.05)，其他4种酯类物质水平较低。同时还发现PBC患者血清代谢产物改变程度比AIH患者更重。除此之外，在正离子模式之下发现血清代谢物中苯丙氨酸在AIH组中水平高于对照组，但与PBC组患者相比差异无统计学意义(P>0.05)。

3　讨　　论

代谢组学是一门新兴的生物学技术,它主要是对人体细胞内代谢层面的若干生命活动进行探索[7]。并且代谢组学的优越之处在于它位于人体代谢活动的最末端，更接近于机体的表面。除此之外，代谢组学还可以放大蛋白质或者基因的微小变化，并且代谢产物的数量和种类也远远小于之前的蛋白质组与基因组[8-9]。由于人体各个组织中的代谢产物都基本相同，故代谢组学的应用也更加广泛。因此，本试验便应用代谢组学的方法来对AIH与PBC的发病机制以及诊断方法进行进一步研究。

本试验采用了超高效液相色谱-质谱研究的方法对AIH组、PBC组与对照组的血清标本进行代谢组学分析，分别将AIH组和PBC组患者的血清标本与对照组进行对比分析，结果显示，在负离子条件下的区别较为明显，差异有统计学意义(t=4.104，P<0.05)。由此可见，这两种疾病的代谢产物有所差别，产生这种差别的原因可能是两种疾病的发病机制存在差异[10-11]。胆汁酸是在肝脏中合成的合成并在人体肠道之中发挥作用的物质。健康人体内的胆汁酸基本不会出现在血液循环中，但绝大多数肝胆疾病患者体内胆汁酸水平明显上升[12]。本试验发现，AIH组与PBC组患者血清中胆汁酸水平明显高于对照组，差异有统计学意义(t=5.102，P<0.05)，其他4种脂类物质水平较低。除此之外，在正离子模式下发现，血清代谢物中苯丙氨酸在AIH组水平高于对照组，但与PBC组患者体内代谢该物质比较差异无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，本试验对PBC及AIH患者血清进行代谢组学分析发现其重要临床意义，并确定了5类生物标记物，血清代谢谱分析技术可以为临床提供一个新的思路。但由于本试验取用的标本例数比较少，研究也不够深入，故需进行更深一步的探讨。

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