加米霉素注射液的靶动物安全性试验

颜晓冬, 齐 鹏, 宋 敏, 牛志强, 张 刚, 卜仕金, 梁景乐, 王九峰

(1. 中国农业大学动物医学院, 北京 海淀100193 ;2. 中牧实业股份有限公司, 北京 丰台100070 ;3.扬州大学兽医学院, 江苏 扬州225009)

加米霉素(Gamithromycin)属于一种新型大环内酯类兽用抗生素,白色至类白色晶体粉末,不溶于水,略有吸湿性,在高温条件下稳定,对光不敏感,具有18 个手性中心,重结晶后只有一种稳定晶体构型。 化学名(IUPAC)为：( 2R,3S,4R,5S,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-13-[( 2,6-二脱氧-3-C-甲基-3-O-甲基-α-L-核-己吡喃糖基) 氧]-2-乙基-3,4,10-三羟基-3,5,8,10,12,14-六甲基-7-丙基-11-[[3,4,6-三脱氧-3-( 二甲氨基)-β-D-木-己吡喃糖基]氧]-1-氧杂-7-氮杂环十五烷-15-酮,分子式为C40H76N2O12,分子量为777.04[1-2]。 具有吸收快、分布广、作用时间长、体内残留低、安全高效、靶组织-肺脏中长时间维持有效浓度等优点[3]。 法国梅里亚(MERIAL)动物保健有限公司开发了以加米霉素为活性成分的注射液ZACTRAN®,已在欧盟(EMEA,CVMP,2008)和FDA(NADA, 2011)批准用于预防和治疗由溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica),多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)和睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)引起的牛呼吸系统疾病[4-5]。

为客观评价中牧实业股份有限公司研制的加米霉素注射液对牛的安全性,我们参照《兽药注册资料汇编》以及VICH《新兽药靶动物安全性试验指南》[6],进行了加米霉素注射液对中国荷斯坦牛犊的安全性试验研究。 通过分析加米霉素注射液对受试牛的临床反应、血液生理指标、血清生化指标和组织病理学的影响,以明确加米霉素注射液对靶动物牛的安全性,为其在临床科学安全使用提供数据支持。

1 试验材料

1.1 供试药品 加米霉素注射液,含量100 mL 含15 g(15%),批号：XYHH D004-1,中牧实业股份有限公司。

1.2 主要仪器设备 血细胞分析仪(SYSMEX KX-21 公司),全自动生化分析仪(AU2700,日本OLYMPUS 公司),生物显微镜(XSZ-580A 型,上海中恒公司),离心机(LD5-2A 型,北京雷勃尔公司),组织切片机及其他病理学检查常用仪器设备。

1.3 试剂 血液生化指标测定试剂,中生北控生物科技股份有限公司;瑞士染液、结晶紫染液、中性红染液等自行配制,蒸馏水,冰醋酸,生理盐水,磷酸盐缓冲液。

1.4 实验动物 24 头中国荷斯坦健康牛犊,体重约150 ～200 kg,由扬州大学实验农牧场奶牛场提供。

1.5 实验动物入选标准及适应期 入选牛在试验前1 d 须经兽医检查确认是处于良好的健康状况。下列情况下的牛应从实验中剔除：(1)适应期内濒死的牛;(2)适应期内生病或受伤的牛;(3)试验期内因疾病需要用其他药物治疗的牛。 实验动物在试验前适应新环境一周。

2 试验方法

2.1 试验分组与给药方案 试验方法参考之前的研究[6-9],24 头健康牛犊(12 头公、12 头母),随机分为4 组,每组6 头,每组分别于第0 天、第5 天和第10 天的上午10 点,共给药3 次,颈部皮下注射。受试牛采用耳号标记识别,实验动物分组及给药剂量如表1。

2.2 安全性试验评价指标

2.2.1 临床观察 试验期间对受试牛进行详细的临床观察,主要包括精神状态、食欲、饮水、粪便、听诊心音、记录心率和呼吸频率、注射部位的变化情况,检查发病动物的临床症状、发病数、死亡数等。试验前和试验结束后分别测定增重和饲料转化率。

表1 实验动物分组及给药

2.2.2 血液学和血清生化学检测 在给药前(第0天)、第2 次给药(第5 天)和第3 次给药(第10 天)后的4 ～6 h 内,对所有试验牛颈静脉采集血样,分别进行血液学和血清生化指标的检测。

2.2.2.1 血液学检测 5 mL 血样,1%肝素抗凝,SYSMEX 血液分析仪进行血液学常规检测。 检测的血液学指标：白细胞数、血小板数、嗜中酸性粒细胞数、嗜碱性粒细胞数、嗜中性粒细胞数、红细胞数、血红蛋白含量、红细胞压积、红细胞平均体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度百分比和红细胞分布标准差百分比[6-9]。

2.2.2.2 血清生化学检测 5 mL 血液凝固后吸取血清样品,OLYMPUS AU 2700 全自动生化分析仪进行血清生化学检测。 检测的血清生化指标：钾离子、钠离子、氯离子、氯化钙、葡萄糖、白蛋白、总蛋白、球蛋白、尿素氮、肌酐、甘油三酯、总胆固醇含量,丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱谷草转氨酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)活性[6-7]。

2.2.3 病理学检查 给药结束后24 小时内宰杀对照组及高剂量组的试验牛和试验中所有死亡的牛,及时进行病理剖检和注射部位的眼观检查,观察组织器官的病理变化。 并采集肝脏,肾脏,心脏,脾脏,肺脏、胸腺,淋巴结、十二指肠等组织器官,进行常规检查后,10%中性福尔马林固定,常规石蜡切片,H. E. 染色,光镜观察病理组织学变化。 与对照组比较,如果5 倍剂量处理组未出现与药物相关的组织病理学变化,则较低剂量处理组就不再进行组织病理学检查[8]。

2.2.4 数据统计分析 用SPSS 应用软件系统进行数据的显著性检验。 采用t 检验比较试验组与对照组间均增重、血液学和血清生化学等各项指标的显著性差异[10]。

3 试验结果

3.1 临床观察 整个试验期过程中受试牛全部存活。 对照组、推荐剂量组和3 倍推荐剂量组的所有试验牛的健康状况良好,精神状态、饮水和采食量均正常,无中毒症状,未观察到任何临床病理症状;注射部位一过性肿胀、发热、疼痛,剂量依赖性硬度增加现象,到试验结束时注射部位恢复良好。 5 倍剂量组中有个别牛在每次注射给药后表现出不适症状,表现为不愿站立、坐卧不起、数分钟后有所缓解;注射部位肿胀、硬度增加、皮肤增厚、触诊敏感,到试验结束时仍有3 头牛观察到注射部位的稍许肿胀。

试验期间各剂量组牛的体温、心率和呼吸频率变化相对恒定,统计学分析均无显著性差异。

3.2 增重与消耗饲料量 试验结束时各组试验牛平均增重和平均消耗饲料量的结果见表2。 统计学分析表明,推荐剂量组平均增重略有提高,但与对照组相比无显著性差异(P ＞0.05);3 倍和5 倍推荐剂量组平均增重虽略有下降,但与对照组相比无显著性差异(P ＞0.05)和(P ＞0.05)。 与对照组相比,推荐剂量组的平均消耗饲料量变化不明显;试验期间的1 d 到5 d 内,3 倍推荐剂量组的平均消耗饲料量在统计数据上呈现下降趋势,5 倍推荐剂量组的平均消耗饲料量明显降低,与对照组和推荐剂量组之间差异显著(P ＜0.05);试验开始的7 d 后,3 倍和5 倍推荐剂量组的平均消耗饲料量恢复正常且少许增加。 此外,整个试验期间,与推荐剂量组相比,3倍和5 倍推荐剂量组的平均消耗饲料量下降。

表2 加米霉素注射液对牛生长性能的影响 (¯x±SD,n= 6)

3.3 血液学指标分析 血液学检测结果见表3 ～5。与对照组相比,加米霉素处理组第5 天和第10天的血小板计数增加显著(P ＜0.05)和白细胞计数增加显著(P ＜0.05),并且随用药剂量的增加指标数值有增加趋势,显著差异越明显;加米霉素处理组中除白细胞计数均偏离正常参考范围,其他血液学指标：红细胞数、血红蛋白含量、红细胞平均体积、红细胞分布宽度百分比和红细胞分布标准差百分比均无显著性差异(P ＞0.05);推荐剂量组红细胞参数保持在正常范围内,3 倍和5 倍推荐剂量组中,一些动物的红细胞压积和血红蛋白稍偏离参考范围;我们认为血液学指标的变化是注射部位炎症反应和少量出血淤血所引起的继发症状。

表3 给药前(第0 天)牛血液学指标 (¯x±SD,n=6)

表4 给药后(第5 天)加米霉素注射液对牛血液学指标的影响 (¯x±SD,n= 6)

表5 给药后(第10 天)加米霉素注射液对牛血液学指标的影响 (¯x±SD,n= 6)

3.4 血清生化指标分析 血清生化指标检测结果见表6 ～8。 与对照组相比,所有加米霉素处理组,血清生化指标：钠离子、氯离子、葡萄糖、白蛋白、总蛋白、球蛋白、甘油三酯、总胆固醇等均无显著变化,能够观察到不呈剂量关系的3 倍和5 倍推荐剂量组的谷丙转氨酶、肌酐和尿素氮下降,我们认为这是继发于肾脏和肝脏的少量出血、淤血。

3.5 组织病理学检查 试验结束后将所有试验牛

表6 给药前(第0 天)牛血清生化指标 (¯x±SD,n= 6)

血液生化参数 空白对照组 推荐剂量组(6 mg/kg·bw)3 倍推荐剂量组(18 mg/kg·bw)5 倍推荐剂量组(30 mg/kg·bw)K +(mmol/l) 4.667 ±0.551 4.833 ±0.322 4.933 ±0.379 5.467 ±0.351 CaCl(mmol/l) 2.733 ±0.127 2.73 ±0.135 2.703 ±0.085 2.613 ±0.060尿素氮(mmol/l) 3.733 ±0.416 2.967 ±0.902 2.833 ±0.569 2.633 ±0.777肌酐(umol/l) 83 ±3.606 83 ±5.292 70 ±4.583 84.667 ±16.563丙氨酸氨基转移酶(U/L) 30.33 ±2.517 27.67 ±5.508 30.67 ±5.686 29.33 ±7.234天冬氨酸氨基转移酶(U/L) 66.33 ±4.041 70 ±4.583 71 ±4.583 73 ±12.767乳酸脱氢酶(U/L) 1 079 ±80.299 1 166.67 ±54.519 1 209 ±122.65 1 200.67 ±104.223碱性磷酸酶(U/L) 227.67 ±61.598 177.67 ±74.769 155 ±32.97 164.33 ±13.317

表7 给药后(第5 天)加米霉素注射液对牛血清生化指标的影响 (¯x±SD,n= 6)进行剖检,与空白对照组相比,推荐剂量组和3 倍推荐剂量组的注射部位有炎症反应包括：皮肤、皮下组织增厚,靠近皮下注射部位的肌肉轻度变色,注射部位发红,随着剂量的增加,炎症症状有所严重,推荐剂量组的动物此类症状较轻,给药11 d 后组织增厚和肌肉变色有所缓解,注射部位红色也逐渐消退。 5 倍推荐剂量组的注射部位肌肉剖检有变性症状,结缔组织增生,组织纤维化,面积在6 cm2左右,给药11 d 后增厚肿胀的组织未完全消退。

各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、皱胃、十二指肠、胸腺)大小、色泽正常,未观察到与药物相关的眼观病理变化。 空白对照组和5 倍推荐剂量组采集样品进行组织学检查,显微检查发现：所有试验牛的脏器(心、肝、脾、肺、肾、皱胃、肠、胸腺)均未发现明显的病理组织学变化,仅肺部有轻度淤血,5 倍推荐剂量组的注射部位组织切片有轻微炎症。

表8 给药后(第10 天)加米霉素注射液对牛血清生化指标的影响 (¯x±SD,n= 6)

4 讨论

靶动物安全性试验是新兽药临床试验研究的重要内容,主要用于研究受试药物在治疗范围或治疗范围以上剂量时对生理功能潜在的不良影响。通过此研究,可为临床研究和安全用药提供科学的依据,也可为长期毒性试验设计和开发新的适应症提供参考[11]。

本试验从一般临床症状、体温、心率、呼吸等临床变化、增重与消耗饲料量分析、血液学指标分析、血清生化指标分析、组织病理学检查等多方面,对以加米霉素注射液的推荐剂量、3 倍推荐剂量、5 倍推荐剂量颈部皮下注射的受试牛进行安全性研究和评估。 从试验结果可以看出,使用推荐剂量和3倍推荐剂量的加米霉素注射液,整个试验期间受试牛精神状态、饮水、采食和粪便等均未出现异常,体温、心率、呼吸频率、增重和消耗饲料量等与空白对照均无显著性变化,虽然部分试验牛的血液学和血清生化指标有不同程度的变化,但剖检均未发现明显的组织病理学变化,注射部位炎症随着给药时间的延长逐渐消退。 由此可以说明,加米霉素注射液按照推荐剂量应用于牛是安全的。

需要注意的是,使用5 倍推荐剂量加米霉素注射液后,个别受试牛出现不适临床症状,平均饲料消耗量与对照组相比显著下降(P ＜0.05),血液学和血清生化指标个别与对照组有显著性差异,剖检发现肺部轻度淤血,注射部位肌肉显示有变性、结缔组织增生、组织纤维化且伴有炎症,表明,5 倍推荐剂量给药对牛有一定的药物反应。 同其他大环内脂类抗生素一样,加米霉素注射液最常见的副作用是引起机体注射部位肿胀[4-5、12]。

血液生理指标及血清生化指标方面,与剂量相关的血小板计数和白细胞计数增加,我们认为这些改变是继发于注射部位局部炎症过程[13-15]。 同时也能观察到一些不呈剂量关系的谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐下降,但病理组织学检测并未发现受试牛的肝脏和肾脏有明显的病理学损伤,因此,还不能判断为受试牛这些指标的下降一定与使用加米霉素注射液有关。

5 结论

中牧股份有限公司研制的加米霉素注射液,含量规格为150 mL 含15 g(15%),按推荐剂量给药(6 mg/kg·bw)具有较好的安全性。