猫源性人葡萄球菌的分离与鉴定

王鹏勇, 高 尚, 王果帅, 张信军, 鞠辉明, 王彦红

(1.扬州大学兽医学院, 江苏 扬州225009 ;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 江苏 扬州225009)

人葡萄球菌属于凝固酶阴性葡萄球菌,是人体的一种正常菌群,只有在机体免疫力低下时才可能引起机体各部位机会性感染,是一种少见的条件致病菌,主要定植于人体皮肤和黏膜表面。 在人上,人葡萄球菌感染具有耐药率高、慢性反复和难以治愈的特点[1]。 在葡萄球菌菌属中,人葡萄球菌最显著的特征是对甲氧西林的高耐药性,可高达80%以上[2]。 与金黄色葡萄球菌相比,人葡萄球菌缺乏侵袭性毒素和酶类,其致病机制主要是植入动物或人体组织表面形成生物被膜[3]。 随着抗生素的广泛应用,葡萄球菌菌属耐药性迅速增长的问题已成为全球关注的热点,特别是人葡萄球菌感染人引起的疾病日益增高,临床分离率逐渐升高。

近年来,在人体、环境和蚊子中分离出人葡萄球菌的报道有很多[4-5],也有文献报道在野生鸟类和牛中分离到本菌[6-7],但并未有报道显示在猫尿液中分离到本菌。 据报道,本类细菌对常用抗生素如大环内酯类、林可酰胺类、万古霉素类、链霉素抗生素有很强的耐药性[8-9]。

1 材料与方法

1.1 培养基 绵羊血平板、麦康凯琼脂培养基。 其中绵羊血,购自杭州天和微生物试剂有限公司;麦康凯琼脂粉,购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司;琼脂粉与氯化钠,购自国药集团化学试剂有限公司。 培养基按通用组方配制。

1.2 主要试剂 本试验采用的生化培养管和药敏试纸片,购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 试验动物 清洁级BALB/cA 小鼠4 只,健康,生长状况良好,购自扬州大学兽医学院比较医学中心。

1.4 主要仪器 超净工作台(型号为SW - CJ -IL),购自杭州天和微生物试剂有限公司;全自动快速生物质谱检测系统(型号为Microflex),购自Bruker 公司;恒温培养箱(型号为GNP9080),购自上海精宏实验设备有限公司。

1.5 细菌分离 患猫,雄性,1.5 岁,体重3.5 kg,主诉：有尿闭病史,今出现尿淋漓症状,生化结果显示肌酐、尿素均明显升高,经诊断为泌尿系统感染。对患猫腹部进行剃毛消毒后行膀胱穿刺术,无菌采集患猫尿液,随后无菌接种于绵羊血平板中,37 ℃下培养24 h,观察结果。 24 h 后,于绵羊血平板中无菌挑取不同形态的菌落接种于麦康凯平板中,37 ℃下培养24 h,观察结果。 无菌挑取单个菌落进行革兰染色,显微镜下观察。

1.6 生化试验 采用生化鉴定管(购自杭州天和微生物试剂有限公司,操作方法与判定标准参照该公司操作方法与标准),对分离得到的菌株进行生化指标的鉴定。 在37 ℃条件下培养24 h,观察结果。

1.7 MALDI biotyper 分析 在无菌操作台内进行操作,靶板先用无水乙醇清洁,自然干燥。 挑取单个菌落,直接涂抹到MALDI 靶板上,自然干燥。 在单菌落凃层上加入1 μL70%甲酸水溶液,自然干燥。 再加入1 μL 基质溶液,自然干燥后,放入MALDI-TOF(购自Bruker 公司,型号microflex )进行分析,采用flex control 程序进行检测。

1.8 小鼠攻毒试验 购自扬州大学兽医学院比较医学中心的6 周龄小鼠4 只,分为两组。 一组采用攻毒处理,一组作为对照组。 饲养在高锰酸钾熏蒸过的舒适保温环境中,适应环境3 d 后,对试验组接种分离菌。 试验组中雄鼠采用腹腔注射处理,剂量均1 mL。 对照组雄鼠腹腔注射1 mL 生理盐水。 给予相同的鼠粮和水源,饲养观察。

1.9 药敏试验 采用纸片琼脂扩散法进行药敏试验,药敏片的规格为多西环素(30 μg/片)、环丙沙星(5 μg/片)、诺氟沙星(10 μg/片)、头孢曲松钠(30 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、丁胺卡那霉素(30 μg/片)、复方新诺明(23.75 μg/片)、美洛西林(75 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、庆大霉素(10 μg/片)、强力霉素(30 μg/片)、链霉素(10 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)。 药敏结果判定按照杭州天和微生物试剂有限公司发布的标准进行。

2 结果

2.1 细菌分离 将无菌采取的尿液接种无绵羊血平板中,37 ℃条件下培养24 h 后,绵羊血平板上长出大量白色菌落,生长状况良好。 经纯化培养,麦康凯培养基上有菌落生长,但生长状况不良。 镜检如中插彩版图1,可见为葡萄串样革兰阳性球菌。

2.2 生化试验 将分离纯化后的菌落无菌接种于生化鉴定管中,37 ℃条件下培养24 h,观察微量生化管,并判定结果。 结果见表1,本菌可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖等。

表1 分离菌生化试验结果

2.3 MALDI biotyper 分析 MALDI biotyper 分析结果为人葡萄球菌。

2.4 小鼠攻毒试验 攻毒后24 h,攻毒组和空白组小鼠均未发生死亡,攻毒组精神不振、不喜活动,空白组精神、食欲均正常;72 h,攻毒组小鼠死亡,空白组精神、食欲均正常。 对死亡小鼠进行剖检发现,该鼠肝脏充血、出血,呈土黄色,见中插彩版图2。 取死亡小鼠肝脏组织,无菌接种于绵羊血平板上,37 ℃培养24 h,观察可见绵羊血平板上有大量白色菌落生长,菌落形态和分离菌一致。 取肝脏切面作肝脏触片,革兰染色后镜检,观察可见大量紫色、葡萄串状球菌,与分离菌镜检一致,见中插彩版图3。

2.5 药敏试验结果 药敏结果显示,本菌对新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、美洛西林、庆大霉素、妥布霉素、氟苯尼考、环丙沙星、头孢曲松、左氧氟沙星、诺氟沙星、链霉素极度敏感,结果如表5。

3 讨论

分离菌的菌落形态和生化特性均和人葡萄球菌特性一致,结合MBT 分析可确定分离菌为人葡萄球菌。 在葡萄球菌中,溶血和分解甘露醇是判断致病性的重要指标[10]。 本株人葡萄球菌能分解甘露醇,加之攻毒回归试验的证明,表明人葡萄球菌是该猫患泌尿系统感染的致病菌。

表5 分离菌药敏试验结果

人葡萄球菌是存在于皮肤和黏膜的一种正常菌落,属于机会性细菌,只有在动物机体自身免疫力下降时才有致病性。 本菌对四环素类抗生素极为敏感,这与曾伟报道的人葡萄球菌对四环素敏感相符[11]。 葡萄球菌是一类极易产生耐药性的细菌,随着抗生素的广泛应用,葡萄球菌的药敏结果也不尽相同,因此在临床治疗中最好根据药敏结果选用合适的抗生素治疗。 这样不仅可以有效的治疗疾病,提高治疗效果,更能减少超级细菌的产生。 在本病例中,我们根据药敏试验结果选择丁胺卡那霉素进行治疗,用药后患猫明显好转,10 d 后顺利出院。

尿液的细菌培养和药敏试验在犬猫泌尿系统感染的治疗中起着至关重要的作用,为该病的诊断和治疗指明了方向,也提供了科学的依据。 在等待尿液培养和药敏结果期间,我们可以先根据患病动物的临床症状选择抗菌谱相对较小的经验性一线抗生素以控制感染,缓解动物的不适,如阿莫西林、头孢氨苄等。 优先选择经泌尿道排泄的抗生素。待药敏试验结果出来后,根据药敏试验结果调整用药。 如药敏结果显示已使用的抗生素存在耐药现象,而动物的临床症状在用药后得到改善,那么我们可以继续使用该抗生素;如药敏结果显示已使用的抗生素存在耐药现象,而动物的临床症状在用药后未得到改善,那么我们可根据药敏试验结果选择合适的抗生素继续治疗。

在动物的饲养管理中,预防远远大于治疗。 因此我们在日常应把重点放在疾病的预防上,注重宠物日常的基本营养摄入,提高宠物自身的免疫力。