兔宿主防御肽RSRAH 的稳定性和抗感染保护作用研究

李晓芬, 王毅东, 张志强, 高启红, 陈丽娟, 陈红伟

(西南大学动物科学学院, 重庆 荣昌402460)

宿主防御肽(Host defense peptides,HDPs),也称之为抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs),再起初称之为抗菌肽(Antibacterial peptides),随后研究发现有些“抗菌肽”还可以抗真菌、抗病毒和抗寄生虫等,故改称抗微生物肽。 由于AMPs 往往是真核生物的先天免疫系统的重要组成成分,因此很多学者又将其称为宿主防御肽[3]。 HDPs 具有广谱的抗微生物活性和非特异性作用机制,因此,被视为克服临床获得性耐药的有效替代方法[2]。

家兔圆小囊(sacculu srotundus)是具有丰富淋巴样组织的部位,是兔特有的一个集消化、免疫和神经内分泌为一体的多功能器官,是兔特有的肠道相关性淋巴组织[4]。 相关文献研究表明,在兔圆小囊组织中发现有大量抗菌肽类物质存在[5],后续研究发现属于NP2 防御素[4]。 我们参考王可洲[4]的分离提取方法,调整改进后采用“机械破碎+乙酸浸提+分子筛层析+离子交换”法分离纯化,并经NanoLC-ESI-MS/MS 分析鉴定结合生物信息学分析发现其中的抗菌活性物为一种组蛋白H2bc 类似物,由于来源于兔圆小囊,所以简称为RSRAH(Rabbit Sacculus Rotundus Antimicrobial Histone)[6]。 本试验为了进一步研究该HDPs 的性质和功能,特开展了其稳定性和抗感染保护作用研究,报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂及实验动物 中性蛋白酶等：北京索莱宝科技有限公司;头孢噻呋钠冻干粉：齐鲁动物保健品有限公司等。 大肠杆菌(ATCC 25922)等菌株：由西南大学兽医工程技术研究中心提供。

抗菌肽RSRAH 的制备和纯化：取家兔圆小囊组织,采用乙酸粗提,经硫酸铵沉淀法去除杂蛋白,用AKATA 蛋白纯化系统和分子筛Sepharose 4FF、阴离子交换填料Qsepharose HP 进一步去杂蛋白,将该电泳纯蛋白冷冻干燥后于-20 ℃保存备用[6],临用时用灭菌生理盐水配制成不同浓度的受试液。

清洁级KM 小鼠(体重相近、健康的断奶小鼠)：由西南大学荣昌校区实验动物中心提供。

1.2 主要仪器与设备 AKTAPRIMER.Plus 型蛋白质纯化系统(通用电气医疗集团);菲恰尔GL -12A高速冷冻离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)等。

1.3 不同理化因素对RSRAH 的抗菌活性的影响

1.3.1 温度对RSRAH 的抗菌活性影响 将RSRAH 分别置于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃水浴中加热10 min,以金黄色葡萄球菌(CVC1882)和大肠杆菌(ATCC25922)标准菌株为受试菌,以室温(25 ℃)为对照,采用“琼脂糖弥散法”测定其抑菌效果。 每个处理设6 次重复。

1.3.2 反复冻溶对RSRAH 抗菌活性的影响 将RSRAH 分别反复冻融1、2、4、6、8、10 次,以未经冻融处理的样品作为对照。 体外抗菌活性试验同1.3.1。

1.3.3 不同蛋白酶对RSRAH 抗菌活性的影响

37 ℃水浴条件下,用反应浓度均为1 mg/mL 的中性蛋白酶(Neutral protease)、胃蛋白酶(Pepsase)、胰蛋白酶(Trypsase)分别处理RSRAH 30 min,以不加酶处理的为对照。 体外抗菌活性试验同1.3.1。

1.4 最小致死菌量(MLD)试验 将50 只小鼠,随机分为5 组,每组10 只,设4 个不同浓度的菌液。 将平皿上的增毒后的大肠杆菌(84-1)临床株接种于营养肉汤中37 ℃孵育18 h,用无菌水稀释为4 个浓度,分别进行小鼠腹腔注射,每只0.5 mL,并在2 h 内对稀释菌液用倾注平板法进行菌落计数,感染后观察记录小鼠死亡数,阳性对照组应具有90%以上的死亡率,阴性对照组应具有10%以下的死亡率,否则继续摸索适宜的MLD。 得到最低致死菌液浓度后,对其进行菌落计数以得出最小致死菌量(MLD)[7]。

1.5 对小鼠急性感染的相对保护率试验 将100只小鼠,按体重随机分为5 个处理组：RSRAH 高(38 mg/kg)、中(19 mg/kg)、低剂量组(9.5 mg/kg)、头孢噻呋钠组( 15.2 mg/kg)、生理盐水对照组。 每个处理组20 只小鼠,各组小鼠均按0.2 mL/10 g·bw 腹腔注射受试液,空白组给予生理盐水,30 min 后每只小鼠腹腔注射0.5 mL 1 倍MLD 的大肠杆菌菌液,随后每6 h 记录死亡情况,得出注射细菌后72 h 存活率,测定各组相对保护率(Relative percent survival,RPS)。 RPS = [1 - (试验组死亡率/对照组死亡率)] ×100%。

1.6 统计学处理 数据采用SPSS22.0 统计软件,统计数据以x±s 表示,采用One Way ANOVA 分析,并用Duncan 比较各数据间的差异。 P ＜0.05 视为两组数据间存在显著性差异。

2 结果

2.1 不同理化因素对RSRAH 抗菌活性的影响 与对照组相比较,经不同温度和反复冻溶处理后的该抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果无显著变化(P ＞0.05);经胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后该抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果极显著降低(P ＜0.01),中性蛋白酶处理后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著降低(P ＜0.05)。 结果见图1 ～3。

图1 不同温度对RSRAH 抗菌活性的影响

图2 反复冻融对RSRAH 抗菌活性的影响

图3 不同蛋白酶对RSRAH 抗菌活性的影响

2.2 MLD 及RPS 结果 经试验,该大肠杆菌(84 -1 临床分离菌株)的最小致死菌量(MLD)为5.5 ×108CFU/mL。

72 h 相对保护率(RPS)分别为：H -RSRAH 组70%,M - RSRAH 组40%,L - RSRAH 组20%,头孢噻呋钠(EFT)组80%。 72 小时内不同时间的小鼠死亡率见图4。

3 讨论

图4 72 h 内不同时间的小鼠累积死亡率(N=20)

前期研究发现,RSRAH 能改善免疫功能低下小鼠的生长性能、提高免疫器官指数,促进小鼠血液中IFN-γ,IL-4 的产生,促进小鼠淋巴细胞增殖,对免疫低下小鼠的细胞免疫功能有促进作用[8]。随后开展了RSRAH 基因的时空表达特性和内源性表达调控等研究,推断RSRAH 是家兔先天性免疫的重要组成成分(有关结果将另文发表),因此将其改称为宿主防御肽(HDPs)。 在关于HDPs/ AMPs的稳定性研究报道中,大部分HDPs 具有热稳定性,在100 ℃下加热10 ～15 min 仍能保持其活性,如马卫明[10]等报道从猪肠道上提取的一种抗菌肽能够在高温、反复冻融、不同的有机溶剂等条件下均具有稳定的生物活性。 此外,部分HDPs 尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力[11]。 本试验发现,RSRAH 具有热稳定、反复冻融稳定和蛋白酶作用不稳定的特性,但值得注意的是该3 项研究内容的对照组(25 ℃、0 次冻融、生理盐水处理)间的抑菌圈大小存在着一定差异,初步分析是由于3 项研究内容是完全独立先后开展的,可能与营养琼脂来源不同或传代的细菌的代次不同有关,是否存在抗菌作用的不稳定性还有待进一步考察。

另外,通过测定临床分离的大肠杆菌(84 -1)的最小致死菌量(MLD)来建立小鼠急性感染模型,发现造模6 h 后生理盐水对照组的死亡率为20%,RSRAH 的中、高剂量组均未出现死亡。 造模18 h后生理盐水对照组的累积死亡率达50%,进入快速死亡期,而RSRAH 的中、高剂量组的累积死亡率仅为10%。 而造模48 h 后生理盐水对照组的累积死亡率达100%, RSRAH 的中、高剂量组的死亡率分别为60%和30%,且后续观察时间内未再出现死亡。 当观察到连续两个时间点的所有试验组死亡率均不再变化作为最终观察时间,即72 h。 通过计算,得出72 h 的相对保护率(RPS),头孢噻呋钠对照组为80%,RSRAH 高剂量组为70%,中剂量组为40%,低剂量组为20%。 试验结果表明,宿主防御肽RSRAH 对小鼠急性感染具有抗感染保护作用,并呈现典型的剂量依赖性。