规模化猪场O型口蹄疫抗体水平监测与分析

2018-04-16张俊波印双红陆安法陆志松

猪业科学 2018年3期

张俊波，印双红，陆安法，白明，陆志松

（1.铜仁学院农林工程与规划学院（铜仁市文化科技产业创新研究中心），贵州铜仁 554300； 2.铜仁学院大健康学院，贵州铜仁 554300；3.铜仁市动物疫病预防控制中心，贵州铜仁 554300）

0　引言

口蹄疫( Foot-and-mouth disease， FMD) 是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)所引起的偶蹄动物的一种急性高度接触性传染病[1]。该病一旦发生可呈暴发性流行，其中包括牛、水牛、猪、绵羊、山羊和骆驼等20个科的70多种家养和野生哺乳动物容易受其感染[2]。据调查显示与一般传染病不同的是它较易从一种动物传给另一种动物，且由于病毒型不同，因此，每个单独的病毒型都可引起动物的一次发病，新流行地区发病率可达100%，老疫区发病率在50 %以上[3]。在世界动物卫生组织(OIE)与联合国粮农组织 (FAO)的排行榜上口蹄疫就稳居“A类动物传染病之首”的位置[4]。早在14世纪的时候意大利学者第一次描述了FMD，1898年，Loeffler等人证明了口蹄疫的病原体为滤过性的病毒，已经发现口蹄疫的病原体主要有7个血清主型（O型、A型、C型、亚洲Ⅰ型、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南非Ⅲ型），2013年在我国发生的口蹄疫疫情主要是O型和A型[5，6]。

目前，FMD在世界的分布很广，是国际间相互进行传播流行蔓延的世界性传染病，几乎所有的国家都有记载，在1514年首次在意大利报道以来，最近的一个世纪就先后在美国、墨西哥、加拿大、丹麦、中国等国家和地区出现，给全球畜牧业和世界贸易带来严重的危害，每年用于预防和损失赔偿的耗资就达60～120亿美元，2012年世界动物卫生组织的统计数据显示：全世界已经消灭口蹄疫的国家69个，新西兰则是历史上从未发生口蹄疫的国家[7]。我国流行的血清型（O型、A型）给口蹄疫防治提出巨大的要求，且由于造成严重的经济损失和社会影响，历来受到各国政府的关注，针对口蹄疫的治疗尚无有效药物，疫苗免疫是最有效的一个方法[8]。业界内最为关心的话题是猪群口蹄疫的免疫效果，口蹄疫的免疫效果能直接影响猪群的健康状况，体现出抗体水平和保护率高低的差异，而影响免疫效果的原因有很多，如疫苗种毒的抗原性、疫苗的质量、猪群的健康状况等，我国猪群现使用的口蹄疫灭活(合成) 疫苗普遍存在免疫原性欠佳的情况，养猪场采取多次强化免疫的方法来提高抗体水平，但如何使各生理阶段的猪只都达到足够高的抗体水平，在什么情况下要进行多次强化免疫等方面未达成共识[9]。经调查贵州地区对猪O型口蹄疫抗体水平监测的统计较少，贵州累计有三次监测统计：2007年文明等人采用LB-ELISA方法对贵阳地区家畜口蹄疫免疫抗体监测结果分析[10]。2009年秋季动物防疫期间，刘波等人采用口蹄疫正向间接血凝试验对黎平县猪口蹄疫免疫抗体进行监测及分析[10]；2013年6月，赵福崴等人在春季动物疫病集中免疫期间采用酶联免疫吸附试验对遵义市猪O型口蹄疫进行监测[11]。

养殖业是铜仁地区一大特色产业，且养猪作为当地居民一个经济来源，大多数人以猪肉为主要肉食，由于地方经济比较落后，猪场规模不大，一般属于小规模猪场(＞100头)，猪口蹄疫又是严重危害养猪业的传染病，且铜仁市各个县城和市区的猪肉市场主要是由这些猪场提供货源，所以这些猪场的猪是否健康直接影响各个县城和市区人民的健康。养猪业遵循“预防为主，防重于治”的有效方针，所以全面了解铜仁市猪口蹄疫免疫水平至关重要。本次调查于2015年5月、11月对铜仁市8个县、2区的各乡（镇）随机抽取17个规模养猪场内保育猪、肥育猪、公猪、母猪、哺乳仔猪进行春、秋两次猪O型口蹄疫血清学调查工作，收集数据，比较不同地区春季和秋季的免疫抗体水平情况，为铜仁地区的口蹄疫的防治提供参考。

1　材料与方法

1.1 血清样品准备

随机抽取的铜仁市8县2区共17个规模化猪场定点场，每个猪场随机采取30份经口蹄疫疫苗免疫接种21 d以上的育肥猪108份、保育猪117份、哺乳仔猪121份、母猪60份、公猪104份猪血清样本，春、秋各采取510份，见表1。

1.2 材料和仪器

1.2.1 试剂与器材

猪O型口蹄疫病毒ELISA抗体检测试剂盒（由武汉某公司提供，批号，20150412，20150410，20151002）。

1.2.2 主要仪器

振动器；自动酶标仪（美国BioTek仪器有限公司）；单道微量移液枪（eppendorf公司）；8道微量移液枪（Thrmo公司）；恒温培养箱（北京市光明医疗仪器厂）。

1.3 样品采集时间、方法及储存

1.3.1 采集时间

血清共分为两次均等采集，分别是2015年5月和2015年11月。

1.3.2 样品采集方法及储存

对选定的猪要进行前腔静脉采血，具体方法分为3个步骤，如下：

1）猪的保定

对中大猪的保定：用保定绳套住猪的上腭，将绳子斜向上，至猪的颈部皮肤充分崩紧，左右显出两个较深的窝。对仔猪的保定：直接仰卧。

2）进针采血

将猪保定后，选取左右两个窝中较深的一个作为进针点，选定进针点，用碘酊消毒，手持一次性采血盛血器，从对侧肩胛骨呈 45°方向刺入，抽取5 mL血液。

3）血清制备

抽取血液完后立即置于30℃左右环境，倾斜静置半小时左右，每份吸取血清1 mL于 1.5 mL EP 管，要求血清清亮无溶血，做好标记，-20 ℃保存。

1.4 试验方法与结果判定

1.4.1 间接ELISA原理

在试验中加入稀释的对照血清和待测血清，经温育后，若样品中含有猪口蹄疫病毒VP1的特异性抗体，则与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分，再加酶标二抗，与包被板上抗原抗体复合物发生特异性结合，再经洗涤除去未结合的酶结合物，在每孔中加入TMB底物液，与酶反应形成蓝色产物，再加入HF溶液终止反应后，用酶标仪630 nm波长测定各反应孔中的测OD630值，

1.4.2 试验操作步骤

1）解冻。取出冷冻的待测血清置于室温（20～25 ℃），充分解冻后，震荡混匀以备用。

2）将冷藏保存的试剂盒放置室温，使其恢复至室温（20～25 ℃）备用。

3）使用前，将恢复至室温（25 ℃）的浓缩洗涤液摇动并使沉淀溶解（最好在37 ℃水中加热5～10 min），然后根据实验用量用蒸馏水或去离子水作20倍稀释盛于烧杯中备用。做好这些准备工作即可进行检测，流程如下：

4）取抗原包被板（根据样品的多少，可拆分使用），每孔加入稀释好的洗涤液200 μL，静置3 min倒掉液体，并在吸水纸上拍干，共计洗板2次。在分别将稀释好的待测血清和对照各取100 μL加入到抗原包被板孔中，待检样品做1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37 ℃温育30min。

5）甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200 μL、静置3 min倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤5次。

6）每孔加入羊猪酶标二抗100 μL，置37℃温育30min。

7）洗涤5次，方法同5），每次在干净吸水纸上拍干。

8）按步骤6）的操作方法再次进行洗涤。

9）洗涤完后，充分拍干包被孔中的液体，先后加入底物A50 μL，再加底物50 μL，混匀，室温（20～25 ℃）避光显色10 min。

10）显色后每孔加入终止液50 μL，10 min内用酶标仪测定630 nm波长的吸光度值（测定前在振荡器上轻轻振动一下）。

表1　采集信息统计表

1.4.3 结果判定

在酶标仪上测各孔的OD630nm值。试验成立的条件是阳性对照平均OD630nm值均≥0.8，阴性对照平均OD630nm值＜0.3。样品OD630nm值≥0.4时判为阳性。样品OD630nm值＜0.4，判为阴性。严格按照试剂盒使用说明书上的步骤测定其样品OD值。根据农业部规定免疫合格率≥70.00%为免疫合格。

1.4.4 数据处理与统计分析

用Excel软件进行原始的数据处理与统计分析。

2　结果及分析

2.1 不同季节猪O型口蹄疫抗体监测结果与分析

2.1.1 不同季节猪O型口蹄疫抗体免疫水平监测结果分析

检测结果见表2和表3，春季阳性414份，平均合格率为81.83%，从分地区来看免疫合格率较高的有思南县91.67%、石阡县91.67%，江口县93.33%，免疫合格率较低的为松桃县68.33%、德江县65.00%。分地区免疫合格率总趋势为江口县＞（思南县、石阡县）＞碧江区＞沿河县＞（印江县、万山区）＞玉屏县＞松桃县＞德江县。此结果说明春季监测的猪O型口蹄疫抗体，平均合格率为82.67%大于农业部规定的标准（≥70.00%），只有碧江区、万山区、思南县、印江县、石阡县、沿河县、江口县、玉屏县8个地区免疫合格率达到农业部标准，而松桃县（68.33%）、德江县（67.50%）免疫合格率未达到农业部的标准。秋季阳性435份，平均免疫合格率为85.00%，从分地区去来看石阡县免疫合格率，最高96.67%，最低合格率松桃县70.00%，免疫合格率总趋势为沿河县＞石阡县＞思南县＞碧江区＞江口县＞印江县＞玉屏县＞万山区＞德江县＞松桃县。此结果说明秋季监测的猪O型口蹄疫抗体，平均合格率87.58%达到农业部规定的标准（≥70.00%），且各地区的免疫合格率均≥70.00%，抽取的各地区猪O型口蹄疫免疫效果较好。

2.1.2 不同季节猪O型口蹄疫免疫检测结果比较分析

经比较，春秋两季各检测的510份猪血样中，首先春季阳性414份，秋季阳性435份，平均合格率春季（81.83%）＜秋季（85.00%），免疫合格率呈上升的趋势（秋季相对于春季上升了3.17%），免疫合格率只有碧江区、万山区、思南县、印江县、石阡县、沿河县、江口县、玉屏县8个地区免疫合格率达到农业部标准，而松桃县（68.33%）、德江县（65.00%）免疫合格率未达到农业部的标准，即春季监测猪O型口蹄疫抗体有两个地区出现了免疫未达到国家农业部规定的标准，而秋季监测的各个地区都达到农业部规定的标准，此情况说明在春季的基础上部分地区的猪O型口蹄疫免疫情况有所改善，如在春季监测的松桃县、德江县两个地区的免疫合格率分别为68.33%、65.00%并未达到农业部规定的标准，而在秋季监测结果中松桃县、德江县免疫合格率分别达到70.00%、75.00%。此结果说明2015年两次监测猪O型口蹄疫抗体中，各地区秋季猪O型口蹄疫免疫抗体水平要高于春季猪O型口蹄疫免疫抗体的水平。

表2　春季猪O型口蹄疫检测结果

表3　春季猪O型口蹄疫检测结果

2.2 不同类型猪O型口蹄疫抗体水平结果分析

对两次检测的血清样品不同类型猪O型口蹄疫抗体分析，如表4。春季平均阳性率74.10%，公猪阳性率94.23%，阳性率最高，其次是母猪77.78%，依次是育肥猪72.22%、保育猪70.08%、哺乳仔猪56.20%。秋季平均阳性率81.70%，母猪阳性率95.56%，阳性率最高，其次是育肥猪89.81%，然后依次是公猪88.46%、保育猪74.35%、哺乳仔猪60.33%。从整体水平上分析，春、秋季各类型猪阳性水平较高，哺乳仔猪的阳性率较低。

3　讨论

3.1 口蹄疫的传播途径及防御措施

口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物急性高度接触性传染病，其危害的动物种类非常之多，传播速度极快，是其他动物疫病所无法比拟的，目前我国所采用预防口蹄疫的一个重要手段是通过免疫接种口蹄疫疫苗来提高畜群整体的抗体水平，而免疫抗体水平的监测是评估畜群免疫效果的一种重要方式[12]，检测结果中秋季平均免疫合格率85.00%高于春季平均免疫合格率81.83%，可能是5月份相对于11月份温度高，空气湿度不同导致的，口蹄疫传播的途径有空气传播和接触传播两种，即可经吸入、摄入、外伤、人工授精及近距离接触而传染，因此要特别注意猪群气源、圈舍、牧场、集贸市场、运输车辆，针对口蹄疫的防治措施每个国家根据本国实际情况采取封锁、扑杀、焚烧措施和制定出相应的预防、控制、扑灭措施，我国口蹄疫的应对免疫预防的核心措施是对口蹄疫易感动物有针对性地接种疫苗，提高动物抗感染能力，断绝病毒繁殖机会，扑杀病畜及同群畜，而病畜及其同群畜是最危险的传染源[13]。

表4　不同类型猪O型口蹄疫抗体阳性率表

3.2　2015年铜仁地区猪O型口蹄疫血清学调查情况

铜仁地区2015年猪O型口蹄疫抗体水平监测时间分别是5月与11月，在17个规模养猪场，分别随机抽取采自碧江区、万山区、思南县、松桃县、德江县、印江县、石阡县、沿河县、江口县、玉屏县8县2区的猪血清样品，共计1020份，免疫合格份数849份，春季阳性414份，平均免疫合格率81.83%，秋季阳性435份，平均免疫合格率85.00%，春季、秋季平局免疫合格率均大于农业部规定的标准（≥70.00%），表明2015年铜仁地区免疫效果较好。不同阶段猪O型口蹄疫免疫合格率变化情况，春季阳性率56.20%～94.23%，公猪阳性率最高；秋季阳性率60.33%～95.56%，母猪阳性率最高，两次监测都说明哺乳仔猪免疫水平较低。

3.3 铜仁地区猪O型口蹄疫抗体水平差异较大

规模养殖场应重视猪O型口蹄疫抗体监测，开展抗体监测的目的不仅仅是诊断，更主要的是评价猪群的免疫状况，并根据其监测结果对免疫方案进行适当的调整或提供一些预警，本次对铜仁地区17个规模场的监测中，春季平均免疫合格率81.33%，秋季平均免疫合格率85.00%，趋势表现为秋季免疫合格率高于春季，且平均免疫合格率均达到农业部规定的标准，2015年5月杨先富等人对黔东南州16个县(市) 的16个规模养猪场和16个自然村散养生猪开展了血清学调查中，对猪O型口蹄疫免疫抗体水平的检测情况分析用平均免疫合格率（规模场猪O型口蹄疫免疫血清免疫抗体平均合格率为96.55%，散养户免疫抗体平均合格率为73.91%）的变化趋势来确定猪O型口蹄疫的抗体水平[14]，由表3和表4的检测结果不同地区的免疫合格率不相同，其中春季分地区碧江区88.33%（53/60）万山区80.00%（24/30）、思南县91.67%（55/60）、松桃县68.33%（41/60）、德江县65.00%（39/60）、印江县80.00%（32/40）、石阡县91.67%（55/60）、沿河县83.33%（25/30)、江口县93.33%（28/30)、玉屏县 76.67%（46/60），秋季分地区合格率碧江区91.67%（55/60）、万山区83.33%（25/30）、思南县93.33%（56/60）、松桃县70.00%（42/60）、德江县75.00%（30/40）、印江县86.67%（52/60）、石阡县96.67%（58/60），各地区的免疫合格率明显不相同，张智鹏等2012年10月，采用正向间接血凝试验对汉中辖区内的生猪进行了口蹄疫免疫抗体监测，得出规模场与散养户的合格率显示不同地区的合格率不相同的情况[15]，因此要让各个地区的免疫情况都处在相同水平上是达不到的。

3.4 部分地区猪O型口蹄疫抗体水平有待提高

检测结果显示，部分地区免疫合格率较低，如在春季监测的松桃县、德江县两个地区的免疫合格率分别为68.33%、67.50%，并未达到农业部规定的标准，说明免疫程序的某环节未做到位，笔者认为有几下原因：1）在免疫程序及防治上不科学或者执行力不够，因为科学合理的免疫程序及防治能够保证免疫成功率，也能确保其他动物免受疫病的感染，从而使畜群抵御口蹄疫病毒的能力得到加强，避免免疫陷入混乱而导致免疫失败的结果；2）铜仁市的养猪场规模不大，针对猪口蹄疫的防范意识薄弱，相关的技术人员也不健全，且对猪口蹄疫的重视程度不高，使得疫苗免疫的方式或操作不规范，免疫效果相应的也就降低；3）是疫苗质量不过关，运输与储藏不当而引起的疫苗失效[16]。2013年熊胜利等采用正向间接血凝试验对贵州省某规模场猪场O型口蹄疫春秋两防免疫抗体监测及野毒检测显示不同地区的抗体监测结果，一些散养户的免疫合格率较低，针对免疫合格率低的地区，需要加强免疫[17]，如春季中出现松桃县（68.33%）、德江县（67.50%）两个县免疫合格率未达到农业部的标准，而秋季监测的各个地区都达到农业部规定的标准，此情况说明在春季的基础差各地区的猪O型口蹄疫免疫情况有所改善，但对于免疫合格率较低的地区，铜仁市的养猪场应该确立完善的免疫监管制度，且根据检测的大部分地区虽然合格率虽达到农业部规定的标准，但大部分地区都未达到100%的合格率，对这些地区也应该建议实施强化免疫[18]。并且在科学饲养管理的基础上，铜仁地区规模场要建立健全防疫卫生制度，制定科学、规范、具有针对性的本地免疫程序，提高免疫效果[19]。

3.5 不同阶段的猪O型口蹄疫抗体水平，哺乳仔猪抗体水平明显较低

对不同类型猪O型口蹄疫抗体水平结果分析，得出对两次检测的血清样品中春季公猪、母猪、育肥猪、保育猪、哺乳仔猪阳性率分别是94.23%、77.78%、72.22%、70.08%、56.20%。秋季母猪、育肥猪、公猪、保育猪、哺乳仔猪阳性率分别是95.56%、89.81%、88.46%、74.35%、60.33%。春、秋两次检测哺乳仔猪的阳性率都比较低，这与张智鹏等在汉中地区免疫抗体与结果分析中报道不同阶段猪O型口蹄疫抗体仔猪免疫合格率80.15%的结论不一致，而检测的结果显示春季哺乳仔猪的阳性率56.20%，秋季哺乳仔猪的阳性60.33%，哺乳仔猪免疫因受母源抗体的干扰，就很容易造成免疫失败，到了保育阶段或育肥阶段，若不及时了解抗体水平进行补免，再加上环境消毒不彻底，就极易造成口蹄疫病毒的感染，因此应该落实每一个阶段生猪的免疫工作，齐向涛等采用ELISA法对分别采集自北疆地区3个规模化猪场公猪、后备母猪、哺乳母猪、仔猪等不同阶段猪群的血清进行猪O型口蹄疫检测，结果显示，仔猪的阳性率就比较低，针对这一情况提出建议：30日龄之前的仔猪母源抗体依然较高，此时接种会造成免疫抑制，所以此阶段不能进行首次免疫，应该把首次免疫的时间推至40日龄，这样抗体水平不至于太低[20]。

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