肺炎克雷伯菌对替加环素耐药机制研究进展

荆 炜，单新新，程于梦，姚 红，李德喜，杜向党

(河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450046)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是人兽共患的条件致病菌，可在医学临床中引起肺炎、肠炎、脑膜炎、眼内炎、败血症、肝脓肿等严重感染性疾病[1]，位居革兰阴性病原菌感染的第2位[2]。由于多种抗生素的不合理使用，甚至滥用，肺炎克雷伯菌发生严重耐药危机，多重耐药肺炎克雷伯菌(Multidrug-resistantK.pneumoniae，MRKP)在全球范围内迅速播散。MRKP不仅对氨基糖苷类、青霉素类、头孢菌素类等高度耐药[3]，还突破了碳青霉烯类抗菌药的防线，成为“超级细菌”。21世纪，肺炎克雷伯菌与屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及肠杆菌属细菌(Enterobacterspecies)被美国传染病学会评定为耐药情况最严峻的6类细菌，取其各自拉丁文名首字母而简称ESKAPE[4]。

替加环素是第一个被批准用于临床治疗的新型甘氨酰环素类抗生素，也是继米诺环素后开发的新一代四环素类抗生素。它通过可逆结合细菌核糖体30S亚基，阻断tRNA进入核糖体A位点来抑制蛋白质的合成，达到抗菌目的。替加环素与核糖体的亲和力远高于四环素和米诺环素，因此具有更高的抗菌活性，可以治疗大多数革兰阴性菌、阳性菌和厌氧菌以及“非典型”细菌感染[5]，甚至成为治疗产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌等感染的最后一道防线。然而，随着替加环素在临床抗肺炎克雷伯菌感染治疗中的频繁使用，替加环素敏感性下降的肺炎克雷伯菌菌株逐渐增多且存在多种耐药机制。作为目前临床抗感染治疗中面临的最严峻问题，肺炎克雷伯菌对替加环素耐药的相关机制研究备受国内外关注。现就肺炎克雷伯菌对替加环素耐药机制的研究进展进行综述，以便为减少细菌耐药性产生，延长替加环素使用寿命提供理论依据。

1 主动外排泵转运系统

肺炎克雷伯菌的耐药机制复杂多样，其中主动外排泵转运系统是形成肺炎克雷伯菌多重耐药的主要原因之一。主动外排泵广泛存在于肺炎克雷伯菌的基因组中，能将菌体内的药物或作用底物，选择性或非选择性的泵出体外，导致体内抗菌药物浓度下降，表现耐药[6-7]。Piddock L等[8]研究发现除细菌耐药之外，主动外排泵还参与细菌自身代谢产物和有害化合物的排泄，以及细菌早期感染过程中的定植等，表明主动外排泵在细胞体内具有非常重要的生理作用。一株细菌可同时含有多个主动外排泵转运系统且其转运底物具有非特异性，肺炎克雷伯菌通过这些外排系统把多种结构各异的抗菌药物排出体外，最终表现对多种抗菌药物耐药。目前已知参与肺炎克雷伯菌对替加环素耐药的外排泵转运系统有AcrAB-TolC外排泵、OqxAB外排泵、KpgABC外排泵和Tet(A)外排泵变异体，其中AcrAB-TolC外排泵、OqxAB外排泵和KpgABC外排泵均属于耐药结节细胞分化(resistance nodulation-cell division，RND)家族，Tet(A)外排泵变异体属于主要易化子(the major facilitator，MFS)超家族。

1.1 AcrAB-TolC外排泵

AcrAB-TolC外排泵是典型的RND家族外排转运系统，在多重耐药肺炎克雷伯菌的产生过程中起重要作用，由内膜转运蛋白AcrB、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC三部分组成[9]。目前对替加环素耐药的研究表明，AcrAB-TolC外排泵活性与细菌对替加环素是否敏感相关。内膜转运蛋白AcrB受阻遏基因(ramR,marR,socR)编码的转录调控因子(RamA，MarA，SoxS)调控，其上调会导致替加环素敏感性下降[10-11]。He F等[12]在3株产碳青霉烯酶(KPC)且对替加环素耐药的肺炎克雷伯菌中检测到RamA过表达，序列分析发现这3株肺炎克雷伯菌的ramR基因均在相同位点发生突变，功能性试验证实ramR基因突变使RamA的表达不受抑制，间接导致AcrB过表达，引起AcrAB-TolC上调，表现出对替加环素耐药。随后Wang X等[13]发现并非ramR基因突变引起的RamA表达上调都能导致肺炎克雷伯菌对替加环素耐药。在菌株KP51中，即使RamA发生近30倍的过表达，也未导致肺炎克雷伯菌对替加环素耐药，说明肺炎克雷伯菌对替加环素耐药性的产生受多种因素调控。Zhong X等[11]用外排泵抑制剂(EPI)CCCP对外排泵的活性进行评价，结果表明，调控因子MarA、SoxS和RamA均对AcrAB-TolC外排泵的过表达具有贡献。其中RamA与MarA均可参与AcrB的过表达，表明RamA不是赋予肺炎克雷伯菌替加环素抗性的必要基因，MarA可作为替代调节因子，影响AcrB外排蛋白的活性，进而导致肺炎克雷伯菌对替加环素耐药。同时Ye M等[14]从患有阴囊脓肿的病人体内分离到2株对替加环素耐药的肺炎克雷伯菌，对其ramR区域进行测序分析，发现它们的ramR开放阅读框不存在突变，而ramR上游的核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)区域发生一段12 bp的缺失。随后证实ramR的RBS位点缺失影响转录之后的蛋白质翻译过程，间接导致AcrB的表达水平失控，引发肺炎克雷伯菌对替加环素产生抗性。这项研究表明不仅阻遏基因(ramR,marR,socR)突变可引起AcrAB-TolC外排泵过表达，使肺炎克雷伯菌对替加环素耐药，序列缺失也可导致同样的结果。科学监测肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药情况，从多角度进行分子生物学水平研究，将有助于丰富对替加环素抗性机制的认识。Roy S等[15]对引发新生儿血液感染的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌替加环素耐药性进行研究，结果进一步证实RamA的表达增加与替加环素的MIC值增加呈正相关，AcrAB泵的过表达导致肺炎克雷伯菌对替加环素的敏感性降低。

随着研究的深入，Li F等[16]构建了肺炎克雷伯菌中第1个lon基因突变体，并且证明Lon蛋白酶参与细菌中MarA的降解，其功能缺失会导致MarA表达量升高，进而导致AcrAB-TolC外排泵的表达量上调，使肺炎克雷伯菌表现出更强的替加环素抗性。Li F在lon基因中检测到3种不同类型的点突变，互补和基因敲除试验表明，lon突变体比野生型肺炎克雷伯菌显示更强的替加环素抗性，而lon基因敲除株又比突变株显示更强的替加环素抗性。相关研究还指出Lon蛋白酶的失活涉及大肠埃希菌和鼠伤寒沙门菌中替加环素的抗性，但需要进一步研究和证实[17-18]。

以上研究都表明对调控AcrAB-TolC外排泵表达的因子进行深入研究，在研发新药和改良现存药物方面具有重要意义，Rosenblum R等[19]分离到1株无ramA和AcrAB过表达却对替加环素高度耐药的临床肺炎克雷伯菌，猜测肺炎克雷伯菌中存在对替加环素耐药的其他途径。因此，AcrAB-TolC外排泵不是导致肺炎克雷伯菌对替加环素耐药的唯一因素，肺炎克雷伯菌可通过其他未知途径，引起替加环素耐药。

1.2 OqxAB外排泵

OqxAB外排泵也属于RND家族外排系统，由膜融合蛋白OqxA和内膜转运蛋白OqxB组成，是第1个被发现的由质粒编码并且可介导酰胺醇类、喹噁琳类、氟喹诺酮类等多种药物耐药的外排系统。目前关于OqxAB外排泵的流行病学和耐药机制研究相对较少，仅证明oqxAB是OqxAB外排泵系统中起主要作用的保守基因，且携带oqxAB基因的质粒容易在不同种属的细菌间水平传播。Lin Y T等[20]从肺炎克雷伯菌感染的病人体内分离到1株高毒力菌株，该菌株最初是替加环素敏感型(TS)，然后变为替加环素非敏感型(TNS)，发现TNS菌株的rarA和OqxB表达水平提高，认为rarA是肺炎克雷伯菌中OqxB表达的调控因子，且与替加环素抗性机制相关。随后，Sheng Z K等[21]在对替加环素耐药的肺炎克雷伯菌研究中证实rarA是OqxAB 外排泵的正转录调节蛋白，rarA的高表达可引起内膜转运蛋白OqxB表达上调，最终导致肺炎克雷伯菌对替加环素耐药。Zhong X等[11]分离得到2株rarA基因表达水平较高但OqxAB外排泵正常的替加环素耐药肺炎克雷伯菌，说明除rarA之外，还存在一些其他调节因子参与OqxAB的表达调控。此外，OqxAB外排泵介导肺炎克雷伯菌对替加环素耐药是否需要AcrAB外排泵参与，OqxAB外排泵是否与介导肺炎克雷伯菌对替加环素高水平耐药有关，OqxAB 外排泵中的膜融合蛋白OqxA是否对替加环素耐药产生影响等问题还未解决[22]，需要进一步探索。

1.3 KpgABC外排泵

KpgABC外排泵是一种新型的RND家族外排泵。Nielse L E等[23]在肺炎克雷伯菌的外排泵操纵子上游发现了1个IS5插入序列引起外排泵KpgABC表达上调，随后将此外排系统导入至缺失kpgABC基因的菌株中，药敏试验结果显示，替加环素MIC值上升4倍。同时，通过克隆转化试验证实，即使没有AcrAB-TolC外排泵的参与，单独的KpgABC外排系统即可导致肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药水平大幅度升高。插入序列(insertion sequence)由一段编码转座酶的DNA序列组成，是一段最简单的转座子。它位于不同的质粒或位点上，携带1个保守的通用的三联氨基酸DDE模体，作为转座酶的活化位点，进行转座酶编码，转座自己或整个转座子。IS5作为家族成员最多的插入序列对耐药基因的转移发挥着至关重要的作用。上述研究阐明了肺炎克雷伯菌对替加环素耐药的新机制，完善了我们对替加环素耐药机制的新认识。

1.4 Tet(A)突变体

Tet(A)属于主要易化子超家族(major facilitator super,MFS)外排泵，可引起细菌对四环素高度耐药。Tuckman M等[24]发现tet(A)基因突变可降低大肠埃希菌对替加环素的敏感性；Akiyama T等[25]证明tet(A)基因突变可以降低沙门菌对替加环素的敏感性；Hentschke M等[26]报道了降低替加环素敏感性的tet(A)基因位于转座子Tn1721中，且既能定位于质粒，也可定位于染色体。我们在2017年分离到1株ST11型高毒力肺炎克雷伯菌，此菌株不仅包含碳青霉烯酶在内的多种抗生素耐药基因，还携带tet(A)变异体，功能性试验证实tet(A)变异体可介导肺炎克雷伯菌对替加环素敏感性降低[27]。由于在不同国家的食物，临床样品，环境和人类微生物群落中均能检测到tet(A)基因，越来越多的研究证明含有突变的Tet(A)在四环素抗性细菌中更占优势，tet(A)基因突变作为一个新机制，将促进替加环素耐药性的发展。

2 核糖体蛋白

核糖体蛋白S10由rpsJ基因编码，是核糖体30S亚基的1个组成部分，位于四环素和替加环素在核糖体30S的主要结合位点附近。Villa L等[28]得到3株对替加环素耐药的肺炎克雷伯菌，其中2株具有RamR突变，这与已经证实的AcrAB-TolC外排系统过度表达会导致肺炎克雷伯菌产生替加环素抗性结论一致；而第3株则显示位于核糖体30S亚基中与替加环素作用靶点相邻的S10核糖体蛋白的编码基因rpsJ发生了点突变，联想以往研究证实此突变介导淋病奈瑟氏球菌对四环素高水平耐药，Villa L等对其进行功能验证发现rpsJ突变或改变替加环素结合位点附近的核糖体结构，或扰乱Mg2+离子配位，导致替加环素与16S rRNA的结合减弱，敏感性下降。这是首次提出rpsJ突变与肺炎克雷伯菌对替加环素耐药相关。Beabout K等证实单独rpsJ突变能够赋予粪肠球菌替加环素抗性后，对6种临床常见病原菌进行适应性试验发现大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌均能通过突变rpsJ保守区位点降低替加环素敏感性[29]。因此，核糖体蛋白S10的结构改变也是一种潜在的新机制，值得在后续的研究中予以关注。Lupien A等[30]的研究表明，除了S10之外，核糖体蛋白S3、S13也位于四环素与核糖体亚基的结合域附近，且S3已被证实具有维持四环素结合位点结构完整的功能，同理推断S3蛋白的结构突变也可能会引起替加环素耐药。随着替加环素抗性与rpsJ突变有关的报道越来越多，有研究证实，在没有外排泵参与的情况下，rpsJ基因突变可导致细菌对替加环素特异性耐药，是引起替加环素耐药的第二大原因。

3 展望

近年来，高致病性和多重耐药肺炎克雷伯菌的检出率越来越高，碳青霉烯类药物防线失守使临床抗感染治疗几乎陷入无药可医的地步，如何减少替加环素耐药肺炎克雷伯菌的出现，延长替加环素的使用寿命成为一个全世界关注的热点问题。现有的研究表明，主动外排泵转运系统，尤其AcrAB-TolC外排泵上调引起的耐药是主要的耐药机制；rpsJ基因缺失突变可不依赖菌种而导致替加环素耐药，成为新的替加环素抗性机制。

上述耐药机制的深入研究，可为改进现有抗生素，开发新型抗菌药物提供新思路。鉴于替加环素在治疗多重耐药菌株肺炎克雷伯菌的重要性，迫切需要加强对替加环素耐药肺炎克雷伯菌的监测。

参考文献：

[1] 贺晓珊，梅传忠.肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展[J].西部医学,2014,26(1):124-126.

[2] 康燕菲,田平芳,谭天伟.肺炎克雷伯氏菌毒力因子的研究进展[J].微生物学报,2015,55(10):1245-1252.

[3] van Duin D,Kaye K S,Neuner E A,et al.Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae:a review of treatment and outcomes[J].Diagn Micr Infec Dis,2013,75(2):115-120.

[4] Pendleton J N,Gorman S P,Gilmore B F.Clinical relevance of the ESKAPE pathogens[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2013,11(3):297-308.

[5] 孙桂凤，陈 頔，孙 钊.新一代抗菌药物替加环素的研究进展[J].药品评价,2014(12):21-23.

[6] 张大勇.肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展简述[J].医学美学美容,2015(3):661-661

[7] 方美芝，陈婷婷，蔡贝贝，等.主动外排泵介导鲍曼不动杆菌耐药性研究进展[J].中华临床医师杂志,2016,10(2):256-259.

[8] Piddock L J.Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance.[J].Nat Rev Microbiol,2006,4(8):629.

[9] 徐 婷，金顺鑫，王 潇，等.细菌外排泵系统acrAB-tolC的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2016(9):92-95.

[10] Veleba M,Schneiders T.Tigecycline resistance can occur independently of the ramA gene inKlebsiellapneumoniae[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(8):4466-4467.

[11] Zhong X,Xu H,Chen D,et al.First emergence of acrAB and oqxAB mediated tigecycline resistance in clinical isolates ofKlebsiellapneumoniaepre-dating the use of tigecycline in a Chinese hospital[J].PLoS One,2014,9(12):e115185.

[12] He F,Fu Y,Chen Q,et al.Tigecycline susceptibility and the role of efflux pumps in tigecycline resistance in KPC-producingKlebsiellapneumoniae[J].PLoS One,2015,10(3):e0119064.

[13] Wang X,Chen H,Zhang Y,et al.Genetic characterisation of clinicalKlebsiellapneumoniaeisolates with reduced susceptibility to tigecycline:Role of the global regulator RamA and its local repressor RamR.[J].Int J Antimicrob Agents,2015,45(6):635.

[14] Ye M,Ding B,Qian H,et al.Invivodevelopment of tigecycline resistance inKlebsiellapneumoniaedue to deletion of ramR ribosomal binding site[J].Int J Antimicrob Agents,2017,50(4):523-528

[15] Roy S,Datta S,Viswanathan R,et al.Tigecycline susceptibility inKlebsiellapneumoniaeandEscherichiacolicausing neonatal septicaemia (2007-10) and role of an efflux pump in tigecycline non-susceptibility[J].J Antimicrob Chemother,2013,68(5):1036-1042.

[16] Li F,Chen Q,Shi K,et al.Step-wise increase in tigecycline resistance inKlebsiellapneumoniaeassociated with mutations in ramR,lon and rpsJ[J].PLoS One,2016,11(10):e0165019.

[17] Linkevicius M,Anderssen J M,Sandegren L,et al.Fitness ofEscherichiacolimutants with reduced susceptibility to tigecycline[J].J Antimicrob Chemother,2016,71(5):1307-1313

[18] Nicoloff H,Dan I A.Lon protease inactivation,or translocation of the lon,gene,potentiate bacterial evolution to antibiotic resistance[J].Mol Microbiol,2013,90(6):1233-1248.

[19] Rosenblum R,Khan E,Gonzalez G,et al.Genetic regulation of the ramA locus and its expression in clinical isolates ofKlebsiellapneumoniae[J].Int J Antimicrob Agents,2011,38(1):39-45.

[20] Lin Y T,Huang Y W,Huang H H,et al.Invivoevolution of tigecycline-non-susceptibleKlebsiellapneumoniae,strains in patients:relationship between virulence and resistance[J].Int J Antimicrob Agents,2016,48(5):485.

[21] Sheng Z K,Hu F,Wang W,et al.Mechanisms of tigecycline resistance amongKlebsiellapneumoniaeclinical isolates.[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(11):6982-6985.

[22] Chiu S K,Chan M C,Huang L Y,et al.Tigecycline resistance among carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae:Clinical characteristics and expression levels of efflux pump genes[J].PLoS One,2017,12(4):e0175140.

[23] Nielsen L E,Snesrud E C,Onmusleone F,et al.IS5 element integration,a novel mechanism for rapidinvivoemergence of tigecycline nonsusceptibility inKlebsiellapneumoniae.[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(10):6151-6156.

[24] Tuckman M,Petersen P J,Projan S J.Mutations in the interdomain loop region of the tetA(A) tetracycline resistance gene increase efflux of minocycline and glycylcyclines[J].Microb Drug Resist,2000,6(4):277-282.

[25] Akiyama T,Presedo J,Khan A A.ThetetAgene decreases tigecycline sensitivity ofSalmonellaentericaisolates.[J].Int J Antimicrob Agents,2013,42(2):133-140

[26] Hentschke M,Christner M,Sobottka I,et al.Combined ramR mutation and presence of a Tn1721-associated tet(A) variant in a clinical isolate ofSalmonellaentericaserovar Hadar resistant to tigecycline[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(3):1319

[27] Yao H,Qin S S,Chen S,et al.Emergence of carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae[J].Lancet Infect Dis， 2017.pulished online November 1,2017.http://dx.doi.org/10.2016/S1473-3099(17)30628-X.

[28] Villa L,Feudi C,Fortini D,et al.Genomics of KPC-producingKlebsiellapneumoniaesequence type 512 clone highlights the role of RamR and ribosomal S10 protein mutations in conferring tigecycline resistance[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(3):1707-1712.

[29] Beabout K,Hammerstrom T G,Perez A M,et al.The ribosomal S10 protein is a general target for decreased tigecycline susceptibility[J].Antimicrob Agents Chemother,2015,59(9):5561-5566

[30] Lupien A,Gingras H,Leprohon P,et al.Induced tigecycline resistance inStreptococcuspneumoniaemutants reveals mutations in ribosomal proteins and rRNA[J].J Antimicrob Chemother,2015,70(11):2973.