肾脏铜稳态平衡调控机制研究进展

李 鹤，孙胜悦，黄元龙，杨文艳,2,杨连玉,2*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2.吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林长春 130118)

铜参与包括以糖类、氨基酸、脂肪酸等营养素形式等存在，在细胞呼吸作用下释放能量，并将多余的能量储存于腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)中，ATP用于酶催化合成、细胞跨膜运输和蛋白质降解。铜维持生命不仅需要细胞中铜的稳态调节，而且需要铜转运到与其相应的配体中，避免氧化应激反应(Oxidative stress reaction,ROS)。铜稳态的调节需通过有效、正确地运输和储存金属，来满足其在细胞、器官以及个体的需要。此外，在哺乳动物的整个生命周期中，不同的发育阶段，器官对铜的需求量也不同。实际上，肝脏铜含量最高，其次是大脑、心脏和肾脏，肌肉和骨骼铜含量最低。铜的排泄,一部分通过胆汁,由粪便排出,另一部随血液经肾脏滤过,由尿液排出[1]。肾脏既是铜的排泄器官也是储铜器官。有研究报道肾脏是仅次于肝脏的第二储铜器官,肾脏的铜含量随着饲粮铜添加水平的增加而增加[2]。本文将阐述铜在肾脏细胞及组织中的吸收、储存和排泄的转运过程，以揭示哺乳动物机体铜稳态调节机制。

1 肾脏细胞铜摄入与其胞内的稳态

1.1 铜的摄入与肾脏细胞内铜稳态

肾脏作为铜排泄的器官，在铜稳态中发挥了一定作用。无论是缺铜或铜积累条件，肾脏会调控铜的含量来维持铜稳态。肾脏中肾小球的滤过作用可维持机体的渗透压及血压平衡，而肾小管和集合管的重吸收与分泌作用可进行物质跨模转运。动物通过日粮摄取铜后，进入血液，经过肾小管和集合管的重吸收作用，与多种铜转运因子结合，将铜转运至小管液中，最终随着尿液排出体外。肾小管上皮细胞是铜转运蛋白(CTR1)转运的主要场所，髓袢细胞为铜转运P型ATP酶(ATP7A,ATP7B)的主要场所，在集合管细胞中细胞色素氧化酶与铜进行结合的主要场所。研究发现肾小管上皮细胞铜稳态平衡不仅依靠CTR1、ATP7A、ATP7B之间相互调节转运[3]，而且需要两种重要的铜伴侣蛋白，即抗氧化蛋白1(ATOX1)、超氧化物歧化酶伴侣蛋白(CCS)，以及在肾细胞中特异性不强的铜转运蛋白(CTR2)，还有在肾脏铜稳态中降低铜毒性具有重要作用的金属硫蛋白(MT)。

1.2 铜在肾脏细胞内储存、转运及胞内的铜稳态

对哺乳动物而言，铜摄取可维持其正常的生长发育，CTR1对铜吸收具有关键作用。研究表明，适当水平的铜可维持雄鼠的精子发生，在铜过量时CTR1可转运铜至生精小管以维持细胞铜的稳态[4]。CTR1活性受到其表达位置和胞内铜浓度的调控。CTR1定位于细胞质内的囊泡中，并随着铜浓度的升高产生胞吞作用。付世鑫等研究证实在铜添加量在7.8 μmoL/L～62.5 μmoL/L的猪肾PK-15细胞中，Ctr1mRNA 表达呈双相反应[5]。而在铜浓度过高时，CTR1蛋白会通过加速铜转运调节，来维持机体内铜水平的稳定。Cheng J等[6]在在鱼类肠道吸收和转运铜中发现，鱼的肠上皮细胞随着铜浓度的升高，CTR1蛋白降解加快。铜通过血液进入肾小管上皮细胞，CTR1转运铜来调节肾小管上皮细胞胞内铜稳态。低铜时，CTR1氨基末端蛋氨酸修饰后，内化至细胞质膜以摄取外周铜。高铜时，CTR1分布在肾小管细胞胞内，降低胞内铜的转入，并以流动性胞内铜池的形式贮存铜[7]。CTR1在近端和远端肾小管上皮细胞中表达，并通过肾小球滤过的原尿将铜循环回到血液，此时肾脏CTR1水平升高，全身铜含量降低，这可能有助于尿铜的吸收[8]。总之，CTR1分布在肾脏细胞不同的亚细胞器上，不同的功能分布促使细胞内环境的稳定。

铜转运蛋白CTR2，与CTR1结构类似，有3个跨膜结构域，与哺乳动物CTR1的作用的结构、生理功能相反，对CTR2的作用报道较少。CTR2在哺乳动物细胞转运铜从囊泡进入细胞质，CTR2在细胞质膜对铜转运亲和力较低。研究发现，缺少CTR2 mRNA细胞中唐氏综合征发病率增加，这表明CTR2可能调解细胞的吞噬作用[9]。虽然CTR2已被证实在铜转运中发挥一定作用，但是关于CTR1与CTR2在铜稳态细胞模型中是否有协同调节的机制并不明确，有待进一步的研究。

金属硫蛋白(MT)是肾脏铜吸收的另一个转入因子，虽然能携带多种二价金属离子(Fe2+、Cu2+、Zn2+等)，但Cu2+与其他二价金属相比与MT结合更加密切。随着铜浓度的增加，肾组织MT含量增高，这可能对肾脏组织细胞起到保护作用[10]。而在铜缺乏时，缺乏MT的小鼠胚胎成纤维细胞存活率降低,这揭示了MT在细胞中是铜的一种储存蛋白，在铜缺乏时可以发挥作用。以上表明肾脏铜稳态中，MT在铜摄取方面具有一定的促进和调节作用。

1.3 铜在肾脏细胞内储存、转运及胞内铜稳态的可持续性

进入细胞的铜能立即与其相关小肽和蛋白结合，从而达到消除或抑制铜自由基高毒性的作用。在铜过量时，可通过铜螯合物调控在铜储存发挥生理作用[11]。为此，相关研究大量报道了这些辅助因子即铜伴侣蛋白，铜伴侣蛋白对铜具有较高的亲和性。在某些非特定反应中，铜通过铜结合蛋白之间的相互作用来确保铜离子传递到适合的靶细胞器，从而达到了细胞内铜的贮存、自由基清除，最终形成了肾细胞的铜稳态。

1.3.1 细胞质中铜-CCS-SOD1调节 铜离子进入肾脏细胞，通过铜转运蛋白将铜转运到特定的铜伴侣蛋白和其他配体(如谷胱甘肽或MT)中。铜伴侣蛋白CCS，以二聚体的形式存在。CCS单体由249个氨基酸残基组成，包含了3个功能结构域。CCS能够将铜离子转运到超氧化物歧化酶1(SOD1)上，促使二硫键的形成并激活SOD1。CCS需要Cu、Zn将铜传递到SOD1，细胞内铜稳态调节通过CCS翻译调节的，其表达水平与哺乳动物26S蛋白酶有关。在铜缺乏和细胞内铜升高时，CCS水平降低，导致SOD1蛋白水平表达升高。虽然CCS的调节不直接影响SOD1蛋白表达，但对其酶活具有调节作用。研究表明,CCS基因敲除的小鼠，SOD的酶活显著降低到10%～30%[12]。这表明CCS对SOD1的激活是非常重要的，CCS的独立通路实现将铜直接传递到SOD1。研究表明,对于缺乏CCS的秀丽线虫中，CCS的产生会直接影响铜-谷胱甘肽复合物形成[13]。

1.3.2 细胞质中铜-Atox1调节 与酵母中铜伴侣铜转运蛋白(Atx1-Ccc2)转运铜到分泌器官作用相似，同源哺乳动物铜伴侣蛋白(Atox1)转运铜到ATP酶上(ATP7A和ATP7B)。小鼠缺乏Atox1会使胎盘中的铜转运降低，导致新生仔鼠脑和肝脏铜缺乏。缺乏Atox1还会导致具有铜依赖性细胞色素氧化酶和酪氨酸酶活性的降低。缺乏Atox1的新生儿也表现出围产期及出生后生长严重受损，这表明Atox1在胎盘及全身的ATP7A/B的介导铜转运中发挥关键作用[14]。除了铜伴侣在细胞质中的作用外,Atox1也可以作为一个转录因子，在高铜的条件下从细胞核转入，并与细胞增殖有关的其他基因(如细胞周期蛋白D1)结合，刺激胞外编码超氧化物歧化酶(SOD)蛋白家族成员SOD3基因的表达[15]。Atox1可调节铜并ATP7A/B运输铜到细胞外的分泌腔。在高铜条件下，Atox1在细胞核中积累并激活靶基因进行转录。

1.3.3 线粒体中铜-CCO调节 在哺乳动物中，细胞色素氧化酶(CCO)是线粒体呼吸链复合物Ⅳ，由13个亚基组成，其中10个由核基因编码，3个由线粒体基因编码。与酵母相同，铜转运到环氧化物水解酶(Cox1和Cox2)两个线粒体编码的亚基中,并与CCO铜伴侣蛋白(Cox17、Cox11、Sco1和Sco2)协同转运。缺乏Cox17的小鼠会导致CCO活性受损，胚胎在子宫内早期死亡，这证明线粒体中铜分子伴侣是必要的[16]。在细胞培养中，CCO与铜的亚基相结合，降低了Cox1和Cox2蛋白表达以及CCO活性，Cox17稳定表达受阻[17]，CCO的铜伴侣蛋白Sco1和Sco2蛋白可以将Cox17和2个Cu原子转运到Cox2的Cu A位点。降低CCO活性会引起新生儿肝功能衰竭和肥厚性心肌病，增加了新生儿的死亡率。与Atox1、Sco1、Sco2作用相一致，CCO已被证实不仅是铜关键的组合因子，而且对铜稳态中细胞铜转运有调节作用。而这些与线粒体相关蛋白显然在CCO的合成中发挥重要作用，铜转入特定亚基的过程目前还不清楚，铜是如何通过其他转运体转入线粒体的还有待研究。

2 铜的转出及排泄与肾脏细胞内的铜稳态

铜经过肾脏肾小管和集合管的重吸收作用，吸收的Cu2+离子在胞内形成铜池，而铜的转出、排泄途径会限制胞内铜池的含量，并将过量的铜排泄到原尿中，将铜排出，确保肾脏细胞的铜稳态平衡。哺乳动物的铜离子转运ATP酶(ATP7A和ATP7B)，负责将铜转运到分泌腔，并与铜依赖酶如铜蓝蛋白，酪氨酸酶和其他酶结合。此外，ATP7A和ATP7B在特定的细胞和组织铜转出的过程中起关键作用。这些铜泵主要是通过从胞浆铜伴侣Atox1接受铜，与ATP7A和ATP7B铜跨膜泵与其生理机制相似，它们在铜转出过程中发挥了关键作用[18]。ATP7A基因突变导致门克斯(Menkes)病变，致使肠铜阻塞、外周铜缺乏而产生致命危险，此症状通常发生在2或3周龄。在生理上，Menkes病的表现是无法开启肠上皮细胞基底膜的边缘的铜泵，或者穿过血脑屏障，导致肠道铜的堆积、外周铜依赖酶供应减少。ATP7B基因突变导致威尔逊(Wilson)病，其原因是铜在肝脏和神经组织中的过度积累。由于ATP7A和ATP7B功能是跨膜运输铜，因此产生不同疾病时，会导致特定的细胞和组织发生病变。

在铜饱合的情况下，通过肾小球毛细血管滤过作用铜排出量相对较低。研究表明肾脏中铜缺乏症是很难治愈的,肾脏与其他组织相比更能抵抗低铜状态[19]。ATP7A和ATP7B共同定位于近端和远端肾小管的细胞中，然而只有ATP7A已报道在高铜情况下在部分肾脏基底膜表达,研究发现 ATP7B 在小鼠肾小球及肾髓质中表达[20]。随着细胞中的铜离子浓度增加，血液会以储存铜或肝脏排泄铜来保护肾细胞免受铜毒性[21]。敲除肾脏中CTR1或ATP7A/B的小鼠可以作为一种分析肾脏在铜系统稳态发挥的作用的工具。对其研究，可发现在肾脏中铜转运蛋白对铜的抑制作用。

3 其他类上皮细胞组织铜稳态调节机制的启发

比较不同上皮细胞的铜平衡规律可能有助于揭示肾脏细胞铜稳态调控的新途径。在胎盘和乳腺的上皮细胞铜转运过程中，会发生类似肾小管上皮细胞一样的跨越上皮细胞屏障现象。在胎盘和乳腺细胞可通过改变铜水平以及激素调节来调节ATP7A蛋白的表达[22-23]。在乳腺组织中，上皮细胞顶端质膜区的ATP7B转运蛋白，在催乳激素诱导下，将铜跨越上皮组织屏障，排入到乳液中[24]。此外，现已证实位于基底外侧膜的由催乳素诱导的APT7A和CTR1与乳液中铜增加有关。在胎盘组织中，通过胰岛素和雌激素的调节下，ATP7A及ATP7B在特定位转录被激活，ATP7B携铜位于上皮细胞的高尔基体，然而ATP7A则将铜转出到基底侧膜[25]。

以上的研究表明肾脏中铜吸收可能是通过不同器官间的激素调节及转运蛋白相互作用的结果。与上述推测类似的是关于肝脏激素之一的铁调素，参与肾脏铁吸收的，一并起到关键作用。未来可对肾脏中相关激素或类激素的铜稳态调控机制进一步研究。

4 结语

大量研究已经明确了调节肾脏细胞铜稳态的分子机制。肾脏铜稳态是由多种铜转运蛋白、含铜酶及细胞内外铜水平的动态调控的结果。目前，对于肾脏细胞的几种主要的转运蛋白的调节途径已经充分认识，但在铜伴侣蛋白的干涉、启动子的诱导以及激素调节在肾脏细胞铜平衡调控上有待进一步深入研究。

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