高精料饲粮对反刍动物胃肠道微生物区系的影响及调控

柳君辉 董国忠 田 可

(西南大学动物科技学院，重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆400716)

由于我国人均耕地少，加上地域性与季节性因素限制，我国青粗饲料资源匮乏，并且品质相对较差[1]。在反刍动物实际生产中，常常通过增加饲粮中精料比例来满足动物营养需要以提高生产性能。但是随着精料比例的增加，瘤胃中碳水化合物大量发酵而产生乳酸及挥发性脂肪酸(VFA)，造成瘤胃内pH下降和代谢紊乱，出现亚急性瘤胃酸中毒(SARA)以及腹泻、蹄叶炎、肝脓肿等多种代谢性疾病[2-4]。研究表明，高精料饲粮模式下特别是发生SARA时反刍动物胃肠道内微生物区系发生改变[5]。因此，研究高精料饲粮对反刍动物胃肠道内微生物区系的影响及其调控措施，对提高反刍动物生产性能和机体健康水平具有重要意义。

1 胃肠道微生物区系

1.1 瘤胃内微生物

瘤胃中主要的微生物包括细菌、古生菌、原虫和真菌[6]。细菌多为厌氧菌，并在微生物中占主导地位[7-8]。根据对营养物质的分解作用可将细菌分为纤维素降解菌、淀粉降解菌、半纤维素降解菌、蛋白质降解菌、脂肪降解菌、酸利用菌和产酸菌等。

对瘤胃内微生物进行测序并与RDP数据库进行比对后发现，瘤胃内微生物有13 478个细菌序列以及3 516个古细菌序列。细菌序列中包括19个细菌门，丰度最高的3个分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)[7]。

厚壁菌门中90.6%的序列属于梭菌纲(Clostridia)，剩余的分别属于芽孢杆菌纲(Bacilli)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)以及未分类的厚壁菌。拟杆菌门是瘤胃内第二大细菌门，其中88.5%的序列属于拟杆菌纲(Bacteroidia)，其余的分别属于鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria,1.5%)和未分类的拟杆菌(10%)。变形菌门包括α变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ变形菌纲(Gammaproteobacteria，丰度最高)、δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)和ε变形菌纲(Epsilonproteobacteria，丰度最低)[7]。

古细菌中大约99.6%的序列属于广古菌门(Euryarchaeota)，其余属于泉古菌门(Crenarchaeota)。古细菌多为产甲烷菌(Methanogens)，利用细菌发酵产生的二氧化碳(CO2)和氢气(H2)产生甲烷，甲烷的合成避免H2分压的增加而抑制微生物酶的合成[6]。

此外，瘤胃内还大量存在原虫和真菌，但是它们的营养代谢作用还存在很大的争论[9]。瘤胃内的原虫非常活跃，与产甲烷菌有着密切的关系，能够影响饲粮发酵从而影响终产物包括甲烷的产生[6]。

1.2 瘤胃黏膜上皮微生物

瘤胃上皮的细菌主要由革兰氏阳性菌组成，与瘤胃内容物细菌有差异[10]。Liu等[11]通过qPCR分析发现，可能由于采样部位不同，奶牛瘤胃内容物的16S rRNA基因数量远远高于瘤胃上皮。除了数量的差异，在生物分类上二者也存在不同。在门的水平上，瘤胃内容物的拟杆菌门丰度高于瘤胃上皮，而变形菌门在瘤胃上皮中具有较高丰度。由于拟杆菌能够水解植物细胞壁的可溶性多糖，因此瘤胃内容物中高丰度的拟杆菌有助于降解并发酵有机物质。在属的水平上，丁酸弧菌属(Butyrivibrio)在瘤胃上皮中具有较高丰度。该菌能够产生并释放丁酸，提高宿主的丁酸供应，对瘤胃上皮细胞的增殖有重要作用[11]。

1.3 肠道内微生物

目前，大部分研究都针对瘤胃内微生物，而对肠道微生物区系及其作用重视不够。因此，我们对肠腔中微生物的了解非常有限[12]。

反刍动物前胃微生物的多样性显著高于小肠与大肠。奶牛胃肠道中共有21个细菌门，其中厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、螺旋体门(Spirochaetae)、蓝藻门(Cyanobacteria)和柔膜菌门(Tenericutes)在胃肠道各段中均有发现[12]。

通过对比肉牛肠道中微生物焦磷酸测序后产生的30 315个序列与Greengenes基因库，并使用MOTHUR进行操作分类单元(OTU)聚类分析，发现大多数序列分别属于厚壁菌门(41.22%)、拟杆菌门(33.51%)和变形菌门(12.15%)[13]。拟杆菌门主要存在于网胃以及皱胃中，而小肠(十二指肠、空肠、回肠)和大肠(盲肠、结肠)及粪便中厚壁菌门占主导地位[13]。厚壁菌门中的毛螺菌科在前胃中丰度最高，小肠和大肠中则分别是梭菌科(Clostridiaceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)占主要地位[14]。在拟杆菌门中，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)在小肠中丰度最高，大肠中则是拟杆菌科(Bacteroidaceae)丰度最高[12]。

1.4 肠道黏膜上皮微生物

正常的肠道菌群具有促进肠黏膜修复和生长的作用，细菌通过降解碳水化合物产生VFA，为肠黏膜提供能量，改善组织局部供血，促进上皮细胞修复，增加胰液中胰酶的分泌，促进肠道生长。

奶牛肠道黏膜上共有22个细菌门。除十二指肠外，厚壁菌门在所有胃肠道黏膜菌落中都占据主导地位，而在十二指肠中变形菌门(Proteobacteria)丰度(37.26%)最高。拟杆菌门在网胃、瓣胃、皱胃、结肠和直肠中丰度仅次于厚壁菌门，在瘤胃、空肠和回肠中第二大细菌门则是变形菌门。相比之下，瓣胃、盲肠、结肠和直肠黏膜组织中OTU的数量均高于其各自的肠道内容物[12]。

2 高精料饲粮下微生物区系变化

2.1 瘤胃内微生物变化

高精料饲粮模式下，大量可溶性糖和淀粉快速发酵产生葡萄糖，为微生物生长提供足够的能量及碳源，加快了瘤胃内几乎所有微生物的增殖速度。但是，伴随着VFA的大量产生和积聚，瘤胃pH下降[15]。特别是发生SARA后，瘤胃代谢紊乱，产生大量异常代谢产物，包括脂多糖(LPS)、组胺、酪胺、乙醇和D-乳酸等[15]。

高精料饲粮模式会改变反刍动物瘤胃内微生物菌群的丰度和多样性。以肉牛为例，在门水平上，低精料模式下肉牛瘤胃中含有大量纤维杆菌(Fibrobacters)，而高精料模式下厚壁菌占主导[16]。并且饲粮精粗比不同导致微生物的变化程度也不一致。精料比例越高，肉牛瘤胃内微生物区系变化越明显[16]。Franzolin等[17]将肉牛的饲粮由全干草逐渐过渡为75%的高精料饲粮后发现原虫数量由3.61×105个/mL增至8.03 ×105个/mL。

饲喂高精料饲粮显著降低了山羊瘤胃内微生物菌群的丰度和多样性[18]。低精料及高精料饲粮模式下得到的OUT数量分别为398及315个，二者只有24个OTU相同。饲喂高谷物饲粮显著降低了拟杆菌门和柔膜菌门的相对丰度，提高了绿弯菌门(Chloroflexi)和厚壁菌门的相对丰度和厚壁菌门/拟杆菌门。在属水平上，饲喂高谷物饲粮显著提高了瘤胃菌群中丁酸弧菌属(Acetitomaculum)、艰难杆菌属(Mogibacterium)和未分类的厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)的相对比例，同时帕匹杆菌属(Papillibacter)、海旋菌(Thalassospira)和未分类的拟杆菌(Bacteroidales)的相对比例显著下降[18]。

当山羊饲粮内谷物比例分别为0、25%和50%时，无谷物组的微生物丰度显著高于50%谷物组；随着谷物比例的增加，瘤胃微生物丰度和多样性总体呈现下降的趋势[19]。其中12个细菌门在3种不同的饲粮模式下均有出现，但是丰度存在差异。在50%谷物组中没有发现衣原体门(Chlamydiae)，而是大量存在厚壁菌门(57.0%)及拟杆菌门(32.2%)细菌。随着谷物比例的增加，厚壁菌门以及绿弯菌门丰度呈现递增的趋势，而拟杆菌门以及一些未分类的细菌丰度降低[19]，与上述肉牛瘤胃内微生物变化趋势相一致。

此外，高精料饲粮会增加山羊瘤胃内纤毛虫以及产甲烷菌数量，降低厌氧真菌的密度，丰富古细菌菌群[19-20]。当发生SARA时，瘤胃内容物的液相部分产甲烷菌数量随着瘤胃pH的下降而表现出一致的趋势，而固相部分则呈现产甲烷菌密度增加的趋势[21]。原虫对低pH环境耐受性较高[22]，能够降低产甲烷菌对低pH环境的敏感性而使产甲烷菌获得保护[23]。

饲喂高精料饲粮引起SARA以及炎症反应时，增加了山羊瘤胃中大肠杆菌(Escherichiacoli)的丰度[18]。大量饲喂谷物导致瘤胃pH下降，这种环境使大肠杆菌数量激增，并且它的致病基因导致动物出现免疫反应[24]。

奶牛采食高精料(65%)饲粮而发生SARA后，普氏菌属(Prevotella)丰度比正常情况下增加了1.5倍，是丰度最高的细菌[23]。SARA严重时，纤维降解菌丰度急剧下降，其中白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)下降83%，产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)下降91%，溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)下降29%[23]。此外，乳酸菌群(Lactobacillus)及埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)的相对丰度提高约11倍，反刍兽新月形单胞菌(Selenomonasruminantium)相对丰度提高1.6～2.6倍[23]。乳酸菌是一类重要的淀粉分解菌，分解产生的乳酸能被埃氏巨型球菌及反刍兽新月形单胞菌这些乳酸利用菌利用而产生丙酸盐。增加这些乳酸利用菌能够维持瘤胃内pH，是一种对瘤胃的保护机制[16]。但是目前也有研究认为这一机制的作用不是很明显。在反复发生SARA的公牛中，瘤胃细菌群落多样性增加，细菌组成改变及多样性增加使宿主动物能够逐渐适应高精料饲粮模式[21]。

2.2 瘤胃黏膜上皮微生物变化

肉牛瘤胃黏膜上皮中普氏菌属以及丁酸弧菌属在高精料饲粮模式下及SARA时显著高于粗饲料组[10]。将饲粮中谷物比例逐渐由3%增至75%和92%时，瘤胃上皮中才能够检测到瘤胃杆菌属(Ruminobacter)、密螺旋体属(Treponema)和毛螺菌属(Lachnospiraceae)[25-26]。

2.3 肠道内微生物变化

饲粮精料比例升高导致肠道中pH降低,乳酸及VFA含量上升,拟杆菌数量降低，对厚壁菌门/拟杆菌门也有影响，但是不同肠道部位表现不一致。

高精料饲粮会显著提高山羊回肠内容物的总VFA含量，增加乳酸含量，并降低pH。通过定量PCR分析发现，回肠中拟杆菌门16S rRNA基因表达量显著降低，而厚壁菌门丰度没有显著变化，厚壁菌门/拟杆菌门显著升高。空肠中厚壁菌门与拟杆菌门基因表达量以及它们的比值未出现显著变化[27]。

Dixion等[28]在山羊采食粗饲料与65%高精料2种饲粮后发现，高精料的饲喂方式导致更多可发酵的碳水化合物进入大肠，从而增加大肠的发酵，降低pH，并增加总VFA及LPS含量。盲肠是反刍动物消化吸收的重要部位[28]，进入盲肠的发酵底物会对微生物组成造成巨大的改变[29]。在对全干草饲喂组及65%高谷物饲粮试验组的16S rRAN基因进行焦磷酸测序后发现，高谷物饲粮组肠腔与黏膜中，Turicibacter属与梭菌属(Clostridium)占据主导地位，与全干草组相比丰度显著提高[29]。此外，肠腔中拟杆菌属和黏膜上Mucispirillum属丰度与全干草组相比下降[29]。

2.4 肠道黏膜上皮微生物变化

采用高精料饲粮饲喂时，OUT数量及微生物丰度和多样性显著下降，微生物菌群受到显著影响[30]。通过MiSeq测序表明，采食高精料饲粮后山羊结肠黏膜细菌群落中厚壁菌门(67.34%)占据主导地位，其次分别为拟杆菌门(13.24%)、变形菌门(10.92%)、螺旋体门(2.87%)和放线菌门(1.42%)[30]。通过主成分分析发现，高精料饲粮改变了结肠黏膜细菌群落，拟杆菌门丰度在高精料模式下升高，布劳特氏菌属丰度由0.07%升至1.21%，并降低了芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)和乳酸球菌属(Lactococcus)丰度[30]。

结肠上寄生着大量黏膜相关细菌，起着物理和免疫屏障作用。但是在发生SARA的奶牛粪便中能够观察到黏蛋白；黏蛋白是上皮组织中具有凝胶能力的糖蛋白，因此可以推断高精料饲喂模式可能导致反刍动物后肠黏膜损伤[30]。由于上皮组织受损以及渗透性改变，LPS可通过消化道上皮进入血液循环而导致炎症反应的发生[31]。

3 高精料饲粮下调控胃肠道微生物区系的措施

3.1 植物提取物和自溶酵母

饲喂富含碳水化合物的饲粮会导致瘤胃微生物区系紊乱，并产生大量异常代谢产物[32]。Neubauer等[33]开展了奶牛瘤胃内添加自溶酵母和植物提取物(包括来源于薄荷、丁香等植物的香料、精油以及非挥发性提取物)的研究。自溶酵母作为纤维素降解菌的底物间接地使瘤胃内纤维降解菌如瘤胃球菌数量增多，并增加对VFA的耐受性[34]。瘤胃球菌被认为是“肠道核心微生物”，在反刍动物胃肠道中多糖的降解和发酵上起着重要作用[13，35]。添加上述植物提取物，减少了淀粉及糖的发酵菌，包括拟杆菌、Shuttleworthiaspp.和互营球菌属(Syntrophococcusspp.)。它们通过抑制微生物对底物的发酵，使产酸的速率减缓，降低VFA、LPS和组胺含量，并增加丁酸盐含量[16，33]。丁酸为上皮细胞代谢提供能源物质，维持肠道黏膜完整性[36-37]。

3.2 烟酸

烟酸具有调节瘤胃内乳酸代谢、避免乳酸的积聚、稳定瘤胃pH的作用。此外，烟酸还能促进瘤胃内微生物的生长，促进瘤胃微生物合成蛋白质，维持微生物区系的稳定[38]。

高精料饲粮会显著增加淀粉利用菌(普氏菌属等)丰度，并降低纤维降解菌(瘤胃球菌以及密螺旋体等)丰度。在肉牛高精料饲粮中添加烟酸可减少普氏菌数量，增加琥珀酸菌、醋酸弧菌和密

螺旋体数量，从而抑制淀粉的利用，促进纤维降解[39]。另外，在高精料饲粮中添加烟酸会抑制主要的乳酸产生菌——牛链球菌的增殖，还会增加原虫的数量。

3.3 有机酸

莫能菌素是使用最广泛的一种离子载体类抗生素，其通过抑制瘤胃内牛链球菌的活动而减少乳酸产生和防止瘤胃pH下降。但是，目前很多国家禁止使用这类抗生素添加剂。因此，可用有机酸代替莫能菌素。有机酸的安全性高，并且不会造成药物残留，但是成本较高，尤其是苹果酸。有机酸一方面通过增加反刍兽新月形单胞菌所需的糖类及蛋白质合成，在瘤胃中促进该菌的生长；另一方面通过增加反刍兽新月形单胞菌对乳酸的吸收利用，防止瘤胃pH下降，并减少异常代谢产物[40]。在山羊饲粮中添加苹果酸使乳酸的利用率比未添加的对照组升高了29%～31%[41-42]。

3.4 益生菌

益生菌主要包括乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等，具有调节消化道菌群平衡、促进营养物质消化吸收以及抑制病原微生物的作用[43]。益生菌进入瘤胃后能够平衡瘤胃内的微生物群落，进而维持瘤胃内pH，对各种消化过程尤其是对纤维素水解和微生物蛋白的合成有着积极作用[44]。这些改善主要是由于增加了纤维分解菌(纤维杆菌和瘤胃球菌)以及乳酸利用菌(巨型球菌和新月形单胞菌)数量[45]。

3.5 乳酸利用菌和乳酸

在瘤胃内接种乳酸利用菌有助于维持瘤胃环境，减少瘤胃内异常代谢产物。埃氏巨型球菌是一种主要的乳酸利用菌，能与牛链球菌竞争性争夺葡萄糖等底物，抑制牛链球菌的生长。接种乳酸利用菌能够消耗瘤胃内产生的乳酸，防止乳酸积聚和瘤胃pH下降。此外，在饲粮中渐进性地添加乳酸，能够提高瘤胃应对乳酸的能力，以适应消化过程中乳酸的积聚[46]。另外，用乳酸处理饲粮中谷物，可使淀粉结构发生改变，使其在瘤胃内不易发酵，从而降低谷物的降解率而增加过瘤胃淀粉数量，有效地控制VFA产量，使pH维持在较高水平[47-48]。在瘤胃高pH水平下，革兰氏阴性菌能够保持相对稳定，从而减少LPS以及组胺的产生[15]。

4 小 结

在反刍动物实际生产中使用高精料饲粮会导致胃肠道内环境紊乱和微生物区系改变，产生瘤胃异常代谢产物，甚至发生营养代谢病。随着饲粮中精料比例增加，瘤胃及肠道中微生物多样性呈下降趋势，瘤胃内呈现淀粉分解菌增多而纤维降解菌减少，肠道中主要表现为拟杆菌数量降低。系统研究高精料饲粮条件下胃肠道菌群的变化及其调控效果，可为控制高精料饲粮引起的代谢性疾病提供新的思路。