红细胞存储损伤影响因素研究进展

杨丽丽，李 姝，张丽华，苏 燕

（包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头014040）

输血是临床重要的抢救和治疗措施，红细胞(red blood cells，RBCs)是输血治疗中使用最广、用量最多的血液成分。存储RBCs的能量和ATP消耗所导致RBCs形态及生物化学等方面的变化称为RBCs存储损伤。存储损伤会影响血液保存质量，降低RBCs运输和释放氧气的能力，产生潜在有害物质，给临床输血带来安全隐患。了解影响RBCs存储损伤的因素对于安全输血具有重要意义。

1 存储前变异

存储前变异是从血液采集到血液储存阶段所涉及的变异，包括献血者的个体差异和血液采集及成分制备过程的变异，是影响RBCs存储损伤最复杂、最难测量的因素。

1.1 献血者的个体差异

献血者个体差异是影响RBCs质量的主要原因[1]。首先献血者的生活方式会影响RBCs存储损伤：饮食、体育锻炼、吸烟、酗酒等会影响RBCs抗氧化能力；患高脂血症献血者的RBCs溶血率明显增加 、膜流动性改变、氧化应激和炎症标志增加；高脂饮食可能不会引起血浆脂质增高，但可能会引起RBCs功能障碍；体育锻炼的频率、强度也会影响RBCs存储损伤。其次献血者所患遗传病也会影响RBCs存储损伤：例如遗传性血色病(hereditary haemochromatosis，HH)献血者体内铁超载容易导致RBCs氧化损伤[2]；镰状RBCs病症献血者的RBCs溶血率和输注后RBCs清除率增加[3]；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏的献血者由于RBCs受氧化应激影响易发生溶血[4]。另外，献血者的个体差异也可能会影响输血效果。有研究认为女性献血者的RBCs弹性好，溶血率低[5]，然而加拿大的纵向队列研究发现输注女性或年龄在30岁以下年轻献血者的RBCs会增加死亡率[6]，但是瑞典和丹麦的回顾性研究没有发现献血者年龄对受血者30 d或1年死亡率有影响[7]；法国的回顾性队列研究也没有发现献血者年龄、性别和存储时间对受血者1年死亡率有影响[8]。Matthews K等[9]对存储RBCs的变形性进行分析，结果表明RBCs初始质量及变形能力与献血者个体差异相关。

1.2 血液采集和成分制备的过程

不同血液采集和成分分离的过程会影响RBCs存储损伤。血液采集后英国、加拿大和澳大利亚等国要求血液中白细胞应该在室温保存24 h内滤除，然而美国则要求血液中白细胞应在8 h内滤除，否则必须冷冻。白细胞在血液内保留时间过长会影响RBCs的生化特性[10]。加拿大的研究发现不同血液成分分离过程会影响RBCs特性及输血效果[11]。Eckstein M等[12]比较了从室温(RTH)保存24 h的全血中分离的RBCs与从快速冷却(RC)全血中分离的RBCs，测试了它们的经典代谢和氧化损伤标记，结果显示，与RC-RBCs相比，RTH-RBCs第1天钾(1.98±0.26对5.23±65.5 mmol/l)和2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG)浓度降低；RTH-RBCs第42天的溶血率高于RC-RBCs(0.52±0.13对0.37±0.12%)；RTH-RBCs的磷脂酰丝氨酸表达量为0.25±20.20%，而RC-RBCs的为0.07±0.12%；血红蛋白修饰在两组间没有差异；RTH-RBCs在第29天和第42天丙二醛(malondialdehyde，MDA)浓度略高。因此，RC-RBCs和RTH-RBCs只有经典体外参数的微小差异，抗氧化能力和氧化血红蛋白修饰间无明显差异。Patel R M等[13]用Nordion Gamma辐射器，以每袋25Gy的剂量照射RBCs，比较了6组RBCs照射和非照射后，其代谢模式的改变，结果显示，存储7 d内照射组与对照组RBCs的代谢组型相似，而存储大于10 d的RBCs则显示出不同的代谢组型(以储存时间和照射为函数)。照射使这些差异随血液存储时间的延长而明显。在生化水平，照射加速了存储RBCs的代谢老化，细胞膜的代谢物受到显著影响，这可能成为评价RBCs存储损伤的有用生物标志。

2 存储过程

作为RBCs保存的外部环境和营养成分的主要来源，RBCs保护液的组成成分及理化性质的微小变化均可以影响RBCs代谢，进而引起RBCs内和保护液中代谢产物的组成发生改变，进一步影响RBCs代谢和保存质量。

2.1 保护液成分

不同保护液成分会影响存储RBCs的质量。

2.1.1 磷酸盐- 腺嘌呤-葡萄糖-鸟苷-葡萄糖酸-甘露醇对存储RBCs的影响 Lagerberg J W等[14]认为存储在磷酸盐- 腺嘌呤-葡萄糖-鸟苷-葡萄糖酸-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-gluconate-mannitol，PAG3M)、低渗添加液(Erythro-Sol5，E-Sol5)和添加剂溶液-7(additive solution，AS-7)中的RBCs乳酸盐、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和总腺苷酸增加。在盐水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇(saline-adenine-glucose-mannitol，SAGM)和磷酸盐-腺嘌呤-葡萄糖-鸟苷-盐水-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-saline-mannitol，PAGGSM)中储存，RBCs内2,3-二磷酸甘油酸(2,3-bisphosphoglycerate，2,3-BPG)水平迅速下降。在E-Sol 5和AS-7中储存的RBCs内2,3-BPG的下降被抑制，而在PAG3M中，2,3-BPG水平直到第35天仍然保持初始水平，到第56天仍可以检测到。存储在SAGM中的RBCs，其溶血率高于存储在其他AS中的RBCs。 与SAGM相比，储存在PAGGSM、PAG3M、E-Sol5和AS-7中的RBCs能够更好地保持其形态特征。Radwanski K等[15]认为E-Sol5可以减缓RBCs存储损伤，并提高整个储存过程中RBCs的质量。Burger P等[16]认为，在PAG3M中存储的RBCs，35 d内2,3-DPG和ATP水平稳定，但是存储的前21 d葡萄糖消耗量、乳酸产量、果糖-1,6-二磷酸酯和磷酸二羟丙酮水平均较高。

2.1.2 添加剂溶液7对存储RBCs的影响 Cancelas J A等[17]发现，存储在添加剂溶液7(additive solution，AS-7)中第42天和56天，RBCs溶血率和含蛋白质微泡的脱落与存储在AS-1中的RBCs相比显著降低。存储在AS-7中的RBCs自体体内回收率在第42天(n=27)为88±5%，在第56天(n=27)为82±3%，超过了目前所使用溶液的RBCs回收率。 因此，AS-7可以改善长期储存损伤,使体内RBCs活力显著增加。Veale M F等[18]认为AS-7可以改善ATP和2,3-DPG水平，保持较高pH，增加耐渗透性，减少血型糖蛋白A(glycophorin A，GPA)和微粒(microparticles,MPs)的数量。D'Alessandro A等[19]将RBCs重新悬浮于对照组AS-3或试验组AS-7中，利用超高效液相色谱-质谱对229种代谢物进行分析和相对定量检测，结果表明，RBCs在AS-3和AS-7中有许多类似的存储代谢趋势，AS-7中储存的RBCs在储存第1周内代谢活性更高，AS-7可以加速磷酸戊糖途径，使总谷胱甘肽含量增高。此外，AS-7由于无氯化物和碳酸氢盐负荷，因此在存储早期可以改善存储RBCs能量和氧化还原代谢，但在第42天，差异虽然减少，但仍然比较显著。

2.1.3 盐水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇对存储RBCs的影响 能量代谢和游离脂肪酸可能成为存储RBCs结构和功能的重要决定因素。在柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖中收集的RBCs可以在4℃的盐水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇(saline-adenine-glucose-mannitol，SAGM)中储存42 d。在这种受控的但仍然是人造的离体衰老过程中，RBCs积累了可逆或不可逆的损伤。Bardyn M等[20]在71 d内每周追踪RBCs 浓缩物、量化细胞外葡萄糖和乳酸浓度、检测总抗氧化能力以及细胞内还原和氧化型谷胱甘肽水平，评估微囊泡、溶血百分比和血液学参数，最后使用无标记数字全息显微镜记录RBCs 形态学变化和膜波动。结果显示，抗氧化能力以及细胞内谷胱甘肽浓度首先升高，在1周和2周后分别达到最大值；在第5周出现不可逆形态学改变，细胞开始转变为暂时的棘细胞和最终的球状细胞；同时，囊泡和溶血率开始呈指数增长；6周(有效期)后，RBCs内谷胱甘肽降低25%，说明氧化应激增加；膜波动显示RBCs从棘状向球状细胞转变时振幅降低。生物化学和细胞水平的各种病变在储存过程中不断积累，可能也会影响RBCs输注后的体内恢复。Mittag D等[21]研究发现与AS-1相比，存储在SAGM中的RBCs对氧化和体外输血相关应激的敏感性更高。

2.1.4 其他保护液对存储RBCs的影响 Lagerberg J W等[14]认为在磷酸盐-腺嘌呤-葡萄糖-鸟苷-盐水-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-saline-mannitol ，PAGGSM)中储存，RBCs内2,3-二磷酸甘油酸(2,3-bisphosphoglycerate，2,3-BPG)水平迅速下降。在E-Sol 5中储存的RBCs内2,3-BPG的下降被抑制。 Radwanski K等[15]认为E-Sol5可以减缓RBCs存储损伤，并提高整个储存过程中RBCs的质量。

2.2 存储条件

保存液的pH会影响存储RBCs的质量。Chang A L等[22]研究了保存液pH对RBCs存储损伤和输注后RBCs存活的影响。将小鼠浓缩RBCs(packed RBCs，pRBCs)分别储存在标准条件(pH 5.8)、酸性(pH4.5)或碱性(pH8.5)AS-3中，储存期结束时测定血红蛋白、微囊泡产生、磷脂酰丝氨酸外翻、乳酸蓄积和脂质过氧化的副产物。将羧基荧光素标记的RBCs 输入健康小鼠以确定细胞存活，与标准AS-3中存储的pRBCs相比，储存在碱性溶液中的RBCs溶血率、磷脂酰丝氨酸外翻、微囊泡生成和脂质过氧化均降低；而乳酸水平较高，说明pRBCs仍然具有较高的代谢活性。与标准AS-3储存相比，碱性储存增加RBCs 循环半衰期，而酸性储存则降低RBCs 循环半衰期。

2.3 存储时间

存储RBCs大多数生物变量，例如细胞变形性、溶血、pH、乳酸盐、丙二醛和8-异前列烷素等炎症脂质，在存储期间随时间延长而改变，所以储存时间成为评价RBCs存储损伤的主要参数。然而，对RBCs存储损伤的评价不应仅局限于RBCs本身的损伤，更应该关注临床输注效果。但是由于方法上的限制，有关存储RBCs损伤的临床意义仍然有争议。

2.3.1 存储时间不影响输血效果 来自新生儿和接受心脏手术患者的随机对照试验表明[23]，RBCs储存时间与患者的不良临床后果无关，但是由于方法上的限制，有关存储RBCs损伤的临床意义仍然有争议。Halmin M等[24]通过观察性研究发现RBCs的存储时间与患者死亡率之间没有关联。Desmarets M等[25]通过回顾性队列研究发现RBCs的存储时间对受血者1年生存率没有影响。

2.3.2 存储时间影响输血效果 与上述研究结果不同，Chadebech P等[26]抽取存储3 d～8 d(称为新鲜RBCs)和38 h～42 h(旧RBCs)的11个存储RBCs样本，并分别与严重脓毒症患者和健康志愿者的血浆共同培养，37℃保存24 h或48 h，检测衰老标记(磷脂酰丝氨酸暴露、钙流入、活性氧以及RBCs体积)。结果证实，影响严重脓毒症患者输血效果的主要原因是RBCs存储时间，而不是受血者的临床状态。Almizraq R J等[27]利用流式细胞仪(flow cytometer，FC)和动态光散射(dynamic light scatting，DLS)分别检测存储第3天、7天、21天、42天少白RBCs浓缩物(leukoreduced red cell concentrates，RCCs)中细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的含量和大小。TRPS检测结果表明，<200 nm的EVs浓度在整个储存期间显著增加。FC或DLS受到分辨粒度能力<200 nm限制，不能用于EVs浓度检测。 TRPS和FC检测结果显示，与存储第3天EVs相比，存储第42天/43天，≥200 nm的EVs浓度显著增加。利用DLS测量悬浮液中颗粒的平均尺寸时，观察到储存期间EVs平均尺寸增加，说明存储时间会影响 EV的大小和浓度。

3 展望

近年来对存储损伤的不断研究使人们越来越多地认识到存储损伤不仅仅是“存储”引起，存储前的变异也会引起损伤，而且有理由认为存储前变异是影响存储损伤最重要也是最难测量的因素。虽然这方面已经有大量的研究结果，但由于方法和地域的局限性，试验结果仍无法达到共识。此外，由于临床用血的需求量大，设立更多的献血者筛选条件是不现实的，因此，今后将从改进成分分离工艺和保存液成分着手,将RBCs存储损伤的危害降至最低，保障输血安全。