不同蒙药对牛源致病性大肠杆菌体外抑菌效果的筛选

郭雪梅 内蒙古农业大学动物科学学院 010018

王纯洁 内蒙古农业大学兽医学院 010018

斯木吉德 阿日查 张 剑 敖日格乐 内蒙古农业大学动物科学学院 010018

贺志英 内蒙古乌兰察布市卓资县兽医站 012300

大肠杆菌病是由某些血清型菌株引起的一类疾病的总称[1]。致病性大肠杆菌不仅是全球性腹泻的主要病因，而且可导致出血性结肠炎等多种疾病。大肠杆菌的致病性与其侵袭的方法、途径、毒力、数量和种类有关。不同菌株由于感染体的途径或病原体的毒力和数量不同，导致病原体侵入机体后所造成的感染类型不相同。致病性大肠杆菌的毒力因子包括黏附素、毒素和外膜蛋白等，这些毒力因子相互协调，导致宿主入侵后机体免疫力低下，引起多种疾病[3]。

随着抗生素、化学合成药和促生长剂等药物在养殖业上的广泛应用，越来越多的病原菌产生了耐药性，而且耐药性也发生了转移，同时由于药物的毒副作用，药物残留导致的畜产品安全问题也愈来愈突出。我国传统中草药在防治细菌性疾病方面积累了许多宝贵经验，君臣佐使配合，互相协调作用，即可达到补气升阳、扶正祛邪和标本兼治的治疗效果。黄芩、大黄、蒲公英等多味中草药的抗菌活性较强，可以作为治疗大肠杆菌病的首选药。另外有研究表明，生物制剂治疗法和大蒜素治疗法对大肠杆菌病的治疗也有一定的疗效[6]。因此,本研究通过9味蒙药对致病性E.coli O78进行了体外抑菌作用的测定，筛选出抑菌作用良好的菌株，旨在为对大肠杆菌病的预防和治疗提供科学的理论依据。

1 试验材料

（1）试验药品。黄连、甘松、瞿麦、草乌叶、黑云香、姜黄、柯子、大黄和多叶棘豆等9味蒙药均购自内蒙古京远大药房。

（2）供试菌株。牛源致病性E.coli O78由内蒙古农业大学动物科学学院牛生产实验室提供，从呼和浩特周边地区荷斯坦奶牛直肠粪便中提取出来。

（3）试验试剂。麦康凯琼脂培养基、营养肉汤和营养琼脂，购自广东环凯生物科技有限公司；NaOH、HCL、蒸馏水、生理盐水、TTC溶液配制（0.01gTTC购自上海经科化学科技有限公司，0.04g琥珀酸钠用2mL生理盐水混匀）。

（4）试验材料。10mL离心管、96孔板、涂布棒、移菌枪、玻璃培养皿、枪头、移液枪 （1000uL、10uL和200uL）、酒精灯、三角瓶、烧杯和量筒。

（5）试验仪器。YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；D2-1万用电炉，购自北京中兴伟业仪器有限公司；YC-2602医用冷藏箱，购自中科美麦低温科技有限责任公司；SW-CJ-20双人单面垂直送风净化工作台，购自苏州泊莱尔净化设备有限公司；Y1-LRH-400-d生化培养箱，购自北京中西远大科技有限公司；76新锐可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限责任公司。

2 试验方法

（1）药液制备。分别称取黄连、甘松、瞿麦、草乌叶、黑云香、姜黄、柯子、大黄和多叶棘豆各50g放入纱布包中，置于500mL蒸馏水室温浸泡过夜，煮沸1.5小时，过滤药液。滤渣加205mL水，煮沸1小时过滤。2次药液小火浓缩至50mL（即药液中所含生药量为1g/mL），121℃灭菌，4℃保存备用。

（2）E.coli O78菌液制备。将实验室保存的牛源致病性E.coli O78在营养肉汤-麦康凯琼脂-伊红美兰琼脂-营养琼脂培养基中，37℃恒温培养箱中培养18～24小时后，接种于营养肉汤培养基中恒温摇床中，110r/分钟，37℃培养到对数期[9]。采用平板菌落计数法计算菌数，将菌液涡旋震荡混匀，取10mL用生理盐水10倍稀释10个梯度，每个梯度吸取100uL菌液涂布于营养琼脂板上，37℃培养18小时，每个梯度做3个重复，进行菌落计数。选取菌落数在30～300个之间的琼脂板取平均值进行计数。吸取10mL菌液，经过5000r/分钟离心10分钟，弃上清，留沉淀。用高压灭菌的生理盐水洗涤3次，最后用无菌生理盐水菌液浓度调整为1×107 CFU/mL备用。

（3）小鼠致病性的试验。选取20±2g的昆明系小鼠，雌雄各半，设置对照组和试验组，每组10只，分别腹腔注射0.3mL无菌生理盐水和牛源致病性E.coli O7810倍稀释液，72小时内观察牛源致病性E.coli O78对小鼠的致死率。

（4）抑菌圈的测定。将致病性E.coli O78菌液调整为1×107 CFU/mL，用涂布棒均匀地涂布于营养琼脂培养基上，37℃培养1小时，用灭菌的小慑子夹起灭菌好的牛津杯放到涂布好的培养基上，加入200uL药液，重复3次，在37℃恒温培养箱中培养18～24小时后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径。直径大于15mm为极度敏感，大于10mm、小于15mm为高度极敏，大于8mm、小于10mm为敏感，小于8mm为不敏感[8]。

（5）最小抑菌浓度（MIC）测定。采用二倍稀释法，将甘松 、瞿麦、草乌叶、黑云香、姜黄、柯子、大黄和多叶棘豆用肉汤依次2倍稀释，分别稀释11个梯度，加入96孔板的前11孔中，每孔加200uL，随后接入50uL对数期E.coli O78菌液，菌数为1×107 CFU/mL。第12孔加入200uL肉汤和50uL纯菌液作为空白对照。37℃培养18小时后，加入5uL配好的TTC，2小时后观察颜色变化。试验组加入染色剂后，没有被染为红色的最低药物浓度即为该药物的最小抑菌浓度（MIC）。

3 结果与分析

（1）小鼠致病性试验结果。试验组小鼠在腹腔注射致病性E.coli O78后72小时内全部死亡，空白组小鼠全部健活；小鼠注射致病性E.coli O78后可见昏睡、厌食和被毛蓬松，少数可见黄色拉稀和嘴鼻流出黄色液体。迅速剖检死亡小鼠，可见胸腔和腹腔内有大量黏液渗出；肠道发生肿胀，肠腔内充满腥臭、黄色稀薄的内容物；肝脏、脾脏和肾脏肿大，肝表面及切面出现灰白色的坏死灶；肺肿胀、充血、水肿。

（2）体外抑菌试验结果。黄连的抑菌作用最好，抑菌直径平均值为18.6mm，表现为极敏，其中最大值达到了22.0mm；其次为甘松、草乌叶、大黄和瞿麦，抑菌直径分别为14.0mm、13.8mm、13.2mm和12.4mm,均表现为高敏；姜黄的抑菌直径为7.6mm，表现为不敏；多叶棘豆和柯子没有抑菌圈产生。

不同蒙药对致病性E.coli O78的MIC测定结果，黄连的MIC最低为0.0039g/mL，其次为大黄和甘松，MIC分别为0.0625g/mL和0.125g/mL，瞿麦、草乌叶、姜黄的MIC为0.25g/mL，黑云香的MIC为0.5g/mL，而柯子和多叶棘豆没有MIC的产生。表明除柯子和多叶棘豆外，其余7味蒙药都对致病性E.coli O78有不同程度的抑菌作用，黄连和大黄的抑菌效果较好。

4 讨论

我国的草药资源相当丰富,人们对中成药的疗效和安全性都比较信任，所以草药市场的开发空间十分广阔。但是目前对草药抗菌活性的研究仍处于探索阶段，蒙药方面更是鲜有报道。关于中草药体外抑菌的研究有许多报道，常用的抑菌研究方法有纸片法和杯碟法，这些方法大多是定性分析而非定量分析。纸片法和杯碟法的优点是在一个琼脂平板上可同时进行多种药物或多种浓度的同一种药物的试验,缺点是药物浓度不一，即定量测定不准。纸片法虽然简易操作,但是药液成分复杂,药量的准确性很难控制,敏感度较低。而牛津杯法可定性反映致病菌对药物的敏感程度。微量稀释法不但能够定量测定药物对病原菌的最小抑菌浓度，还可以直观反映细菌在药物作用下的生长状况[10]。鉴于此,本试验采取牛津杯法和2倍稀释法对9味不同蒙药对致病性E.coli O78的体外抑菌活性进行了测定。将两种抑菌试验方法相结合，避免了单独采用一种方法造成试验结果的片面性[11]。

不同蒙药对大肠杆菌的抑菌圈和MIC均有不同，试验中9味蒙药体外抑菌试验结果显示,只有黄连对致病性E.coli O78抑菌圈表现为极敏，MIC最低；甘松、草乌叶、大黄和瞿麦对致病性E.coli O78的抑菌直径表现为高敏，柯子、多叶棘豆既没有抑菌圈的产生也没有MIC的产生。其中大黄抑菌圈直径小于甘松和草乌叶，但MIC却低于两者，猜测出现这种差异的原因主要与单味药的成分有关，不同药物的体外抑菌作用存在一定差异，所使用的药物源、质量和提取方法都与抑菌试验结果有关[12]。

5 结论

将牛津杯法与二倍稀释法联合使用，有效地筛选出9味蒙药中黄连对致病性E.coli O78的抑菌效果最好，其次为大黄、甘松、草乌叶和瞿麦，而柯子和多叶棘豆对致病性E.coli O78没有抑菌作用。表明蒙药在细菌性疾病防治方面有巨大的开发潜力，可以为蒙药的开发和利用提供更为科学的理论依据。