响应面分析法优化碱蓬多糖的脱色工艺

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(1.锦州医科大学,辽宁锦州 121000; 2.锦州医科大学附属第一医院,辽宁锦州 121000)

碱蓬(Suaedasalsa)又名翅碱蓬,俗称黄须菜,属黎科,为一年生叶肉质化真盐生草本植物,具有极强的生命力,属于一种典型的盐生结构[1]。盐地碱蓬的药用价值早在《本草纲目拾遗》中就有记载,“盐蓬,味咸性寒,清热消积”[2]。常食用碱蓬有助于人体酸碱平衡,近年来一些研究表明,碱蓬提取物具有降低胆固醇、降血脂、抗免疫[3-5]、抗衰老、抗肿瘤等功效,对于保健及功能药物的开发具有重要意义[6-7]。多糖是一种广泛存在于动植物、微生物中的大分子物质,它不仅在生物体的生长发育中发挥重要作用,而且具有多方面的生物活性和功能。随着科学研究的发展,多糖生物功效多样性的研究正日益成为国内外研究的热点[8-9]。

由于碱蓬多糖本身结构复杂,利用传统工艺提取的碱蓬多糖颜色深,纯度低,不利于碱蓬多糖成分的进一步分离和产品的开发。为了能够更好的对碱蓬多糖进行深入研究,需要对其进行脱色处理。活性炭吸附法、大孔树脂法以及双氧水法等方法是目前最常用的多糖脱色方法。通过查阅文献发现,已有赵肖通[10]等人利用大孔树脂法对姬松茸多糖进行脱色,汪荣斌[11]等人利用双氧水法对青钱柳叶多糖进行脱色,但大孔树脂法操作较复杂,且树脂价格较贵,样品处理量有限,不利于大规模应用,双氧水是强氧化剂,容易破坏碱蓬多糖的结构,影响其活性[12-14]。与前两种方法相比,活性炭是最常用的吸附剂,研究发现,活性炭可吸附水解液中相对分子质量为500和1000以内的色素物质,并且可以吸附溶液中的某些杂质,从而达到分离提纯的目的[15]。目前,已有单晓菊[16]、吴光杰[12]等人利用活性炭分别对苦豆子多糖、马齿苋多糖进行脱色。而Box-Behnken实验设计作为一种基于统计技术的优化方法,具有预测性好,便于观察,精密度高等优点[10]。

目前,对碱蓬多糖的分离纯化已见报道,但对碱蓬多糖脱色工艺的研究未见报道。因此本文通过利用活性炭对碱蓬多糖进行脱色处理,在单因素实验的基础上,利用Box-Behnken实验设计对碱蓬多糖脱色工艺条件进行优化。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

碱蓬辽宁省锦州市沿海滩涂湿地,经锦州医科大学附属第一医院主任药师郭斌鉴定为碱蓬属碱蓬草;活性炭天津市瑞金特化学品有限公司,批号:20150823;葡萄糖中国食品药品检定研究院,批号:110732-201406;95%乙醇、苯酚和浓硫酸等试剂均为分析纯。

UV-2550型紫外分光光度计日本岛津;LD4-2A(Ⅱ)离心机北京京力公司;真空干燥箱上海一恒科技仪器有限公司;BP 211D型电子分析天平德国Sartorius公司;PHSJ-4A实验室pH计上海精密科学仪器有限公司;恒温水浴锅上海腾方仪器有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1碱蓬多糖的制备取碱蓬的干燥叶300 g粉碎后,过20目筛,得碱蓬粗粉。称取碱蓬粗粉以80%乙醇回流脱脂2次,每次2 h。提取完毕,过滤,残渣置于烘箱内烘干。残渣加10倍量水于80 ℃水浴锅中加热回流提取2次,每次3 h[6]。浸提后抽滤,离心(3000 r/min,15 min),取上清液浓缩,按Sevag法脱蛋白后,加3倍量的90%乙醇过夜沉淀,离心(2500 r/min,10 min),冷冻干燥24 h,即得碱蓬粗多糖。

1.2.2标准曲线的绘制将葡萄糖标准品在105 ℃干燥至恒重,精密称取20 mg,加水溶解,定容至100 mL容量瓶中,摇匀,配成浓度0.2 mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别准确吸取上述葡萄糖标准液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL分别置于具塞试管中,加蒸馏水补至1 mL,再加入6%苯酚溶液0.5 mL,摇匀,然后沿壁加入浓H2SO42.5 mL,立即摇匀。将6只具塞试管室温放置15 min后,在490 nm处测定各管吸光度,进行三次平行实验,取平均值。以葡萄糖质量浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。得标准曲线方程:A=1.250C+0.009,r=0.9991。

1.2.3单因素实验取1.2.1项下碱蓬多糖溶液,脱色条件为:固定反应条件为脱色温度45 ℃、脱色时间30 min、pH2,考察不同活性炭用量(1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%)对多糖脱色率的影响;固定反应条件为活性炭用量2.5%、脱色时间30 min、pH2,考察不同脱色温度(35、40、45、50、55、60 ℃)对多糖脱色率的影响;固定反应条件为活性炭用量2.5%、脱色温度45 ℃、pH2,考察不同脱色时间(20、25、30、35、40、45、50、55 min)对多糖脱色率的影响;固定反应条件为活性炭用量2.5%、脱色温度45 ℃、脱色时间30 min,考察不同pH(1、2、4、6、8、10)对多糖脱色率的影响。以上每组单因素实验均进行3次重复实验取平均值,以考察各因素变量对碱蓬多糖溶液脱色率的影响。

1.2.4Box-Benhnken中心组合实验设计在单因素实验的基础上,采用中心组合实验Box-Behnken设计方案,选取活性炭用量、脱色温度、脱色时间、pH四个因素,以碱蓬多糖溶液脱色率为响应值,设计四因素三水平的响应面分析实验,各因素的三个水平采用-1、0、1进行编码,如表1。

表1　响应曲面实验因素水平表Table 1　Factors and their levels used in the response surface design

1.2.5碱蓬多糖脱色率的测定准确称取1.2.1项下碱蓬多糖5 g,加水溶解并定容至500 mL,得碱蓬多糖溶液,于450 nm[17]处测定碱蓬多糖溶液脱色前后的吸光度。计算公式为:

脱色率(%)=(A脱色前-A脱色后)/A脱色前×100

1.2.6碱蓬多糖糖损率的测定利用苯酚-硫酸法[18]测定碱蓬多糖溶液脱色前后的多糖含量。计算公式为:

糖损率(%)=(C脱色前-C脱色后)/C脱色前×100

1.3　数据处理

2　结果与讨论

2.1　单因素实验结果

2.1.1活性炭用量对脱色效果的影响由图1可知,多糖的脱色率呈先增加后降低的趋势,当活性炭加入量为3%时,多糖的脱色率增加幅度较大,当活性炭加入量超过3%时,多糖脱色率明显下降,糖损率随着活性炭用量的增加随之增大,原因可能是由于活性炭加入量过大,过量的活性炭可能会对多糖产生少量吸附作用,并且会使脱碳不完全,反而影响多糖的脱色率,综上所述,实验选择活性炭的添加量为3%。

图1　活性炭用量对脱色效果的影响Fig.1　Influence of amount of activated carbon addition on decolorization effect

图2　脱色温度对脱色效果的影响Fig.2　Influence of decolorization temperature on decolorization effect

2.1.2脱色温度对脱色效果的影响由图2可知,在35～50 ℃范围内,多糖的脱色率随着温度的升高上升较快,50 ℃时脱色效果最好,当温度继续升高时,脱色率反而下降,糖损率随着温度的升高而升高。原因可能是由于温度升高,多糖溶液的黏度降低,色素分子运动速度加快,进而加速吸附作用,当达到平衡点时,温度过高反而造成了色素的解析[19]。因此50 ℃是比较适宜的脱色温度。

2.1.3脱色时间对脱色效果的影响由图3可知,在20～40 min内,随着时间的延长,多糖的脱色率上升较快,糖损率上升缓慢,当脱色时间超过40 min时,多糖的脱色率缓慢降低,糖损率增长迅速,可能是由于活性炭吸附已经达到一定程度,吸附与解吸附处于相对平衡,继续延长脱色时间,反而会引起部分被吸附色素的解析,综合考虑,脱色时间应为40 min。

图3　脱色时间对脱色效果的影响Fig.3　Influence of decolorization time on decolorization effect

2.1.4pH对脱色效果的影响由图4可知,随着pH的增加,多糖的脱色率呈先增高后降低的趋势,在酸性范围内多糖的脱色率较高,说明活性炭在偏酸性条件下脱色效果好,但继续降低pH,后期所需要的碱液以指数倍数的增加,增加了成本,同时会产生大量的盐,为后续脱盐带来不便[15],并且糖损率也随着pH的增大而增大,因此,为获得较好的脱色效果,选择pH4为较适宜。

图4　初始pH对脱色效果的影响Fig.4　Influence of decolorization pH on decolorization effect

2.2　响应面实验设计及结果

2.2.1响应面实验设计结果由Design-Expert 8.0.6统计分析软件的实验设计功能可知,以碱蓬多糖脱色率为响应值,以活性炭添加量(A)、脱色温度(B)、脱色时间(C)、pH(D)为自变量,建立四因素三水平的中心组合设计包括29个实验方案,每个实验方案进行3次平行实验取平均值,具体的实验方案及实验结果如表2所示。

表2　响应面实验设计及结果Table 2　RSM design and corresponding experimental data

表3　回归模型及方差分析Table 3　The variance analysis of regression equation

注：**p<0.01为极显著;*p<0.05为显著。

2.2.2模型的建立及其显著性检验利用Design-Expert 8.0.6软件,通过回归分析对表2中实验数据进行回归拟合,得到活性炭添加量(A)、脱色温度(B)、脱色时间(C)、pH(D)四个因素对碱蓬多糖脱色率(Y)的二次回归方程为:Y=64.30+0.68A+2.30B+0.99C+0.57D+1.27AD-1.04BC+1.13CD-1.90A2-1.79B2-1.03C2-1.44D2

图5　活性炭用量与pH交互作用对脱色率的响应面分析Fig.5　RSM analysis for interactive effects of amount of activated carbon addition and pH

2.2.3响应面图分析响应面分析法是利用合理的实验设计,通过对响应面等高线的分析寻求最优工艺参数,并且可以通过对3D曲面图的分析,直观地评价各因素间的交互作用[20-21]。在响应面图中,曲面的倾斜度表明该实验因素对响应值的影响程度,倾斜度越高,即坡度越陡峭,表明该实验因素对响应值的影响越显著。响应面等高线图可以直观地反映出两个因素间交互效应的强弱,等高线的形状越接近椭圆形,表示两个因素交互效应越强,而圆形则反之[22]。如图5～7所示,各图响应曲面坡度较陡峭,说明AD、BC和CD之间交互作用较强。

图6　脱色温度与脱色时间交互作用对脱色率的响应面分析Fig.6　RSM analysis for interactive effects of decolorization temperature and decolorization time

图7　脱色时间与pH交互作用对脱色率的响应面分析Fig.7　RSM analysis for interactive effects of decolorization time and pH

图5表示固定脱色温度和脱色时间为零水平,活性炭用量和pH对多糖脱色率的影响和两者之间的交互作用。活性炭用量较低时,脱色率随pH增加呈先上升后下降的趋势,活性炭用量较高时,脱色率随温度增加先上升后下降;固定pH不变时,多糖脱色率随活性炭用量增加呈先上升后下降的趋势。通过图5可以看出,活性炭用量上升的幅度较pH稍陡峭,说明活性炭用量对多糖脱色率的影响较pH稍大。

图6表示固定活性炭用量和pH为零水平,脱色温度和脱色时间对多糖脱色率的影响和两者之间的交互作用。由该图可知,脱色温度和脱色时间对多糖脱色率的影响是明显的,因为响应曲面坡度陡峭,等高线图接近圆形,同时也说明它们的交互作用并不明显。多糖脱色率随脱色温度和脱色时间的增加,先上升后缓慢下降,脱色温度的上升幅度明显比脱色时间的上升幅度陡峭,说明脱色温度对多糖脱色率的影响较大。

图7表示固定活性炭用量和脱色温度为零水平,脱色时间和pH对多糖脱色率的影响和两者之间的交互作用。脱色时间和pH对脱色率的影响都是明显的,因为曲面比较陡峭,等高线图是椭圆形,所以证明它们的交互作用也是明显的。固定pH不变时,多糖脱色率随脱色时间的增加呈先上升后下降的趋势。综合图7分析可知,脱色时间上升的幅度较pH稍陡峭,说明脱色时间对多糖脱色率的影响较大。

2.2.4验证实验本实验以碱蓬多糖脱色率为最终考察指标,根据Design-Expert 8.0.6软件对所得回归方程的最优预测值求解,可得活性炭对碱蓬多糖脱色的最佳工艺条件为:活性炭用量3.25%,脱色温度52.72 ℃,脱色时间43.18 min,pH5.39,活性炭脱色率的理论预测值为68.52%。考虑实际条件,调整为活性炭用量3.3%,脱色温度53 ℃,脱色时间43 min,pH5.4。在上述最优条件下进行重复3次平行实验,验证实验所得平均脱色率为65.38%,RSD为1.74%。结果表明,经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合,证明本实验建立的二次多项回归方程模型能准确预测各因素与效应面之间的关系。

3　结论

多糖溶液中色素成分大部分为天然产物中已存在的物质,对多糖溶液进行脱色有利于提高多糖的纯度,优良的脱色剂应具有较理想的脱色效果、较低糖损率,同时又容易在多糖中清除,但是要保证脱色前后多糖的结构不发生改变。活性炭为黑色多孔颗粒,无臭、无味、无毒,具有孔隙结构发达、比表面积大和吸附能力强的特点,活性炭对水溶性色素具有稳定可靠地脱色效果[12],因此常常被用来做吸附剂。

本实验利用活性炭对碱蓬多糖溶液进行脱色处理,降低了色素含量,在单因素实验基础上,采用Box-Behnken响应面实验设计,根据Design-Expert 8.0.6软件进行分析,对碱蓬多糖的脱色工艺进行优化,建立了多糖脱色率的回归模型,由该模型优化的碱蓬多糖脱色的最佳工艺条件为:活性炭添加量3.3%,脱色温度53 ℃,脱色时间43 min,pH5.4。此条件下,碱蓬多糖的平均脱色率为65.38%,与模型预测结果相近,表明该响应面法优化的工艺条件具有实用价值,有利于碱蓬多糖的进一步研究和产品的开发。

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