江西水稻根结线虫病的发生及鉴定

叶梦斐，孙晓棠，张 磊，崔汝强



江西水稻根结线虫病的发生及鉴定

叶梦斐，孙晓棠，张 磊，崔汝强*

（江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045）

2016年，江西省南昌县和新建县的直播水稻出现大面积的斑块状枯黄，调查发现这些水稻的根部具有根结，同时从土壤当中分离到大量的根结线虫2龄幼虫。运用分子生物学技术对采自这2个水稻种植地的根结线虫进行鉴定，确定该根结线虫为拟禾本科根结线虫（）。拟禾本科根结线虫病是水稻产区一种重要的线虫病害，在我国江西则是首次发现。

拟禾本科根结线虫；水稻；鉴定；江西

根结线虫（spp.）广泛分布于世界各地，寄主范围广，危害大，是最具危险性的植物寄生线虫之一，世界每年由根结线虫所引起经济上重要农作物的损失占总损失的5%。水稻根结线虫寄生在水稻根部，植株地上部仅表现株矮，叶黄，生势衰弱等症状，根部有大量根结出现导致秧苗无法进一步形成须根。多发生在直播稻、育秧田、灌溉地水稻、低洼地水稻、旱稻等田块。

由拟禾本科根结线虫（Golden & Birchfield，1963）引起的水稻根结线虫病是水稻产区重要的病害之一[1]。该线虫病在北美洲、南非、东南亚等地发现并造成严重危害。一般中等发病情况下，影响水稻产量约10%~20%左右，严重发病时可达40%~50%[2-6]。目前引起水稻根结线虫病的线虫种类多种，而拟禾本科根结线虫仅在我国海南三亚及福建的水稻、葱（）有记录[7-9]，但未见造成水稻损失的报道。近年来在江西南昌县、新建县等地发生水稻根结线虫病，造成局部严重为害。鉴于其经济重要性及病害的突发性，作者对病原线虫进行鉴定，报道如下：

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2015年2—7月，在江西省的南昌和新建直播稻种植区采集水稻根及根际土。采用贝曼漏斗分离法[10]分离土壤中的根结线虫雄虫和2龄幼虫，收集根结线虫在水稻根部的卵囊，用单卵囊接种到温室培养的水稻苗上，进行根结线虫纯化扩繁培养。

1.2 单条 0. nnnn活虫DNA的提取

在解剖镜下将水稻根结线虫单条的二龄幼虫用解剖刀切断后加入含有8 μL WLB溶液［含2.5 mmol/L DTT，( Tween20) = 1.125%，0.25 g/L Gelatin，125 mmol/L KCl，3.75 mmol/L MgCl，25 mmol/L Tris－HCl ( pH 8.3) ］的PCR管中，于-70 ℃放置30 min后；95 ℃处理15 min；随后65 ℃温浴2 min；再加入20 mg/mL的蛋白酶K 1 μL，65 ℃温浴30 min；95 ℃处理15 min后作为单根结线虫PCR扩增的DNA模板[11]。

1.3 DNA鉴定

利用引物C2F3（5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3′）和1108（5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′）[12]对水稻根结线虫序列进行扩增。PCR反应的混合液总体积为50 μL。反应体系为：2 μL模板DNA，5 μL10×PCR buffer，4 μL dNTPs（10 mmol/L），1 μL引物ITS1/ ITS4（10 μmol/L），0.3 μL TaKaRa（5 U/L），36.7 μL ddH2O。反应程序：95℃，4 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，1 min；32个循环；72 ℃延伸5 min。

1.4 PCR产物的电泳检测

取PCR产物各3mL，12 g/L琼脂糖中加5% EB染液，100 V电泳35 min，凝胶成像系统拍照。根据DL2000 Marker推断PCR扩增产物大小。切胶回收PCR产物连接到pMD18T载体上，单菌落PCR筛选出来的阳性克隆。

1.5PCR产物测序及序列分析

阳性克隆送上海Life生物有限公司进行测序分析。测序结果登录到GenBank 数据进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 田间症状

水稻根结线虫病在整个水稻生育期都能感染发病，目前江西主要在直播稻的苗期发病明显。发病部位主要在水稻根部，地上部分表现出植株矮小，黄化，生长不良等症状。

图1 水稻根结线虫病在水稻根部的主要症状

水稻根结线虫病，由根结线虫二龄幼虫自根冠上方侵入到水稻根部，在根内寻找寄生位点并与水稻建立寄生关系，进一步发育成成虫。在根结线虫食道腺分泌的效应子的作用下于寄生位点形成巨型细胞，造成水稻根部膨大形成根瘤，并影响水稻须根的形成（图1），进而影响秧苗对水分和营养的吸收，地上部分表现为秧苗矮小，黄化，生长不良，分蘖量下降等症状（图2）。

图2 水稻根结线虫病田间症状

2.2 PCR扩增结果

采用引物C2F3和1 108对拟禾本科根结线虫DNA序列PCR扩增，经12 g/L琼脂糖电泳检测分析显示，各单条线虫样品均增出特异性较好片段约为500 bp的产物（图3）。

图3 单条拟禾本科根结线虫扩mtDNA电泳

2.3 分子鉴定结果

对PCR产物进行测序，测序结果表明该片段为531 bp，将该片段登录GenBank数据库进行比对分析显示与数据库中已知拟禾本科根结线虫（GU187309)同源性为100%。可将该线虫鉴定为拟禾本科根结线虫。

3 讨 论

本研究利用特异DNA序列鉴定出在江西省的南昌和新建的直播稻发生的水稻根结线虫病的的病原为拟禾本科根结线虫，目前该病原线虫已经对江西省部分直播稻种植区造成了严重的经济损失，本研究也是首次对江西省拟禾本科根结线虫为害直播稻的详细报道。1963年在美国路易斯安那州的光头稗（L.）上首次发现了拟禾本科根结线虫[11]，随后研究表明该线虫可寄生水稻、葱以及多种单子叶杂草的根部，为害水稻后会造成严重减产，甚至毁田[12]。

江西省地处亚热带温暖湿润季风气候，雨量多、年平均气温在16~19 ℃，而且作物经常多年连续种植，导致各种病害发生严重，且在水稻生长季节特别适合根结线虫病的发生。一旦根结线虫在水稻种植区定殖下来，很难将其根除。防治该病害则会浪费大量的财力与人力。因此水稻根结线虫病的预防是直播稻生产管理的一个重要问题。由于以前在我省水稻上并为大面积发现水稻根结线虫病为害，而且水稻根结线虫病地上部分表现的症状与营养不良、缺素症等症状类似，容易被农民及农技推广人员忽视。为了保证江西省粮食生产安全，应对我省主要的直播稻种植区开展水稻根结线虫病害的普查及防治推广培训工作；同时，在播种前，对前一生长季节疑似发病的田块进行土壤处理，且定期做好除草工作。

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Identification ofFrom Rice in Jiangxi Province

YE Meng-fei, SUN Xiao-tang, ZHANG Lei, CUI Ru-qiang*

(School of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In 2016, yellow patches emerged on rice in Xianjian County and Nanchang County of Jiangxi Province. Root knots were observed in the rice roots, and numerous juvenile second stage (J2) worms belonging to the genuswere isolated from soils around the rice roots. The root knot nematodes were identified by using mtDNA-PCR-sequence. The results indicated that the root knot was. Worldwide,is known to be an important pathogen of rice in most rice growing area, however, the nematode was found firstly on rice in Jiangxi Province.

；rice；identification；Jiangxi

S432.4＋5；Q959.17

A

2095-3704（2018）01-0052-03

2017-11-04

2017-11-21

国家自然科学基金项目(31260423)、江西省自然科学基金项目（20151BAB204024）、江西省科技支撑计划(20151BBF60076)和江西省教育厅基金项目(GJJ160347)

叶梦斐(1993—)，女，硕士生，主要从事植物病理学研究，1193315379@qq.com；

通信作者，崔汝强，副教授，博士，cuiruqiang@jxau.edu.cn。

叶梦斐, 孙晓棠, 张磊, 等. 江西水稻根结线虫病的发生及鉴定[J]. 生物灾害科学, 2018, 41(1): 52-54.