量子点/硅质体编码纳米载体的制备

陈　伟　赵桂红　孙清江

(东南大学生物科学与医学工程学院, 南京 210096)(东南大学生物电子学国家重点实验室, 南京 210096)

本文通过实验室合成硅质体，混合以功能化修饰的脂质体，利用薄膜水化法将绿色油溶性量子点包埋在硅质体的疏水双层中，将红色水溶性量子点包埋在硅质体空腔内，通过预编码和后编码方式调节绿色、红色量子点的荧光强度，制备的量子点/硅质体纳米载体在模拟细胞环境中结构稳定，且荧光性质稳定.

1　材料与方法

1.1　实验试剂及仪器

实验中硅质体通过多步反应合成得到[10].二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷脂聚乙二醇羧基(DSPE-PEG-COOH)分别购自Sigma Aldrich和Avanti公司.量子点根据文献[11-12]中方法制备，实验室合成水溶性配体(DHLA-PEG-400)，对红色量子点进行改性.AR级氯仿购自南京化学试剂有限公司.实验室配置PB缓冲液(pH=7.4)，所用的去离子水经过Pall Cascade AN超纯水系统处理，电阻率为18.2 MΩ.

实验中使用的主要仪器包括：F-7000型荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；JEM-2100型透射电子显微镜(日本JEOL公司)；Ultra Plus型扫描电子显微镜(德国Zeiss公司)；OSB-2100型旋转蒸发仪(美国EYELA公司)；ZS90型粒度电位分析仪(美国Malvern公司)；TSC-SP8型共聚焦显微镜(德国Leica公司)；CT18RT型离心机(美国Techcomp公司)；KQ-500DB型超声波振荡仪(中国昆山市超声仪器有限公司).

1.2　空白硅质体和量子点/硅质体的制备

采用薄膜水化法制备空白硅质体，取2 mg 硅质体单体在酸性乙醇中25 ℃恒温孵育，抽真空待用.采用适量的氯仿溶解于试管中，45 ℃减压旋转蒸发制成均匀薄膜.薄膜抽真空过夜干燥后加入2 mL PB缓冲液，50 ℃水化20 min，超声处理30 min 后，得到空白硅质体悬液.

采用薄膜水化法制备量子点/硅质体.步骤与空白硅质体的制备相似，取2 mg硅质体在酸性乙醇中25 ℃ 恒温孵育，抽真空待用.采用一定量的氯仿溶液溶解(同时可加入绿色油溶量子点)，45 ℃ 减压旋转蒸发制成均匀薄膜.薄膜抽真空过夜干燥后加入2 mL PB缓冲液(同时可加入红色水溶量子点)，50 ℃水化 20 min，超声处理30 min后， 在6×103和1×104r/min条件下差速离心10 min，利用PB缓冲液复溶，在1×104r/min条件下离心，沉淀得到尺寸均一的量子点/硅质体悬液.功能化磷脂掺杂的量子点/硅质体制备过程同上.本文研究了掺杂不同种类磷脂和不同摩尔比的硅质体、DPPC、DSPE对结构的影响.

1.3　预编码量子点/硅质体的制备

采用薄膜水化法制备预编码量子点/硅质体，步骤与量子点/硅质体的制备相似.通过在制备过程中优化绿色油溶量子点和红色水溶量子点的浓度，预先设计固定发射峰为505 nm的 CdSe/ZnS绿色量子点的浓度为4 mg/mL.然后，改变发射峰为612 nm的CdSe/CdZnS/ZnS红色水溶量子点的浓度，将其设定为1，2，4 mg/mL，制备出绿色和红色荧光强度比为2∶1，1∶1，1∶2的编码量子点/硅质体纳米载体.

1.4　后编码量子点/硅质体的制备

采用薄膜水化法制备后编码量子点/硅质体，步骤与量子点/硅质体的制备相似.首先，按照预编码量子点/硅质体的制备原理，制备出绿色、红色量子点荧光强度比为1∶2的量子点/硅质体，加入5 nmol/L 铜离子，观测35 min内绿色、红色荧光强度比变化，得到后处理的编码量子点/硅质体.

1.5　形态学表征

利用动态光散射仪测定各种硅质体的粒度和Zeta电位.将样品沉积在铜网上，采用2%的钨酸盐溶液进行负染，室温干燥后利用透射电镜对尺寸和量子点包埋情况进行观察.将样品滴涂在铜片上，自然干燥后利用扫描电镜观察粒子形貌，采用元素分析法测定硅质体Si的含量.

1.6　荧光性能表征

利用荧光分光光度计对量子点/硅质体进行荧光测量试验时，选用光电倍增管电压为400 V，狭缝宽度为5 nm，量子点选用的激发波长为380 nm.将样品滴在载玻片上附加盖玻片，倒置放入共聚焦显微镜，观察量子点/硅质体荧光及形貌.

1.7　稳定性实验

为了证明量子点/硅质体在生物医学领域应用的优越性，研究了pH值、生物交联剂以及模拟细胞环境中离子、生物大分子条件对量子点/硅质体荧光强度的影响.

2　实验结果

2.1　空白硅质体和量子点/硅质体的粒径和形态学表征

通过观察空白硅质体和量子点/硅质体在电镜下的形貌可以验证纳米囊泡结构的完整性和立体性.由图1(a)和(b)可知，均匀分布的空白硅质体纳米囊泡粒径为80～130 nm，水合直径为(126.3±5.3) nm.由图1(c)和(d)可知，包覆双色量子点的硅质体仍能保持良好的球形形貌，且量子点清晰可见，大小均一，粒径略有增加，在100～150 nm之间，水合直径为(143.7±6.4) nm.

(a) 空白硅质体TEM

(b) 空白硅质体SEM

(c) 量子点/硅质体TEM

(d) 量子点/硅质体SEM

图1空白硅质体和量子点/硅质体的形态学表征

2.2　功能化磷脂掺杂对硅质体结构的影响

为了提高量子点/硅质体的生物相容性和表面功能化，首先掺杂了20%的DSPC，其电镜结果见图2(a).由图可知，部分纳米球形结构破裂，分析原因在于相变温度较低，成球过程中脂质体不能与硅质体融合均匀，造成塌陷破损.

然后，利用电镜下观察掺杂DPPC和DSPE含羧基官能团(掺杂百分数分别为42.5%和20%)的样本，结果见图2(b).由图可知，球形结构完整并能观察到双分子层结构，尺寸均一，粒径与空白硅质体相似，为80～130 nm.

提高含羧基官能团DSPE磷脂的掺杂百分数，可以提高该纳米载体的表面功能化效率(见表1).当硅质体与DPPC的摩尔比为1∶1时，分别掺杂25%和30%的DSPE，包覆双色量子点后的透射电镜结果见图2(c)和(d).掺杂30%DSPE的量子点/硅质体球型结构不稳定，存在挤压变形，掺杂25%DSPE的量子点/硅质体球型结构饱满，大小均一，粒径为100～150 nm.

(a) 掺杂20% DSPC

(b) 掺杂20% DSPE

(c) 掺杂25% DSPE

(d) 掺杂30% DSPE

图2掺杂功能化磷脂的量子点/硅质体的TEM照片

表1掺杂功能化磷脂的硅质体的Zeta值

ρ/%n纯水PBS201∶1∶1．5-42．7±0．7-8．9±0．4251∶1∶2．0-41．6±0．9-7．4±0．3301∶1∶2．5-39．5±0．7-5．9±0．5注：ρ为DSPE的掺杂百分数；n为硅质体、DPPC和DSPE的摩尔比．

2.3　预编码量子点纳米载体

利用掺杂25%DSPE磷脂的硅质体进行量子点编码.图3给出了预编码方式制得的3种荧光比例量子点/硅质体纳米载体的荧光光谱图.通过调节2种颜色量子点的浓度，可实现量子点/硅质体的绿色与红色荧光强度比分别为2∶1，1∶1，1∶2.通过荧光共聚焦显微镜观察，对应量子点/硅质体分别显示出绿色、黄色和红色荧光.

2.4　后编码量子点纳米载体

利用后编码方式实现对量子点/硅质体的荧光编码.由图4中的荧光光谱变化可知，在预编码方式制备的绿色与红色荧光强度比为1∶2的量子点/硅质体悬液中加入5 nmol/L Cu2+，10 min时荧光强度比变为1∶1，30 min时荧光强度比变为2∶1，且荧光强度趋于稳定.随着Cu2+浓度的提高，其淬灭效率也逐步增强.

2.5　稳定性实验

将预编码方式制备的绿色和红色荧光强度比为1∶1的量子点/硅质体作为稳定性实验样本.如图5(a)所示，在24 h内，pH=5～9的条件下，其荧光强度基本不变.在常用生物交联剂(如可溶于水的碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、亲和素(AV)和链霉亲和素(SA)等)存在的条件下，量子点/硅质体仍能保持良好的荧光稳定性(见图5(b)).在模拟细胞环境中，各种离子强度和生物大分子对量子点的荧光影响见图5(c).由图可知，除了部分重金属离子(如Cu2+)的微弱影响外，荧光强度比基本稳定，说明包覆硅质体可以提高量子点对环境的抗干扰能力.

(a) 2∶1编码

(b) 1∶1编码

(c) 1∶2编码

图4　后编码量子点/硅质体的荧光性能

(a) pH稳定性

(b) 生物交联剂稳定性

(c) 模拟细胞环境的稳定性

3　结果分析

硅质体具有独特的双分子层结构特点，是一种由一层或多层类磷脂分子自组装而成的囊泡.在水溶液中，硅质体单体自然排列成一个密闭的球形，疏水端在膜内侧，亲水端在膜的两侧，可以实现对不同性质纳米材料的包覆.量子点比率荧光技术[13]是以2种荧光强度比作为输出信号的检测技术，具有内部矫正信号、提高检测限等优点.因此，将2种不同性质、不同颜色的量子点分别包覆在硅质体膜内与腔内，可构建出比率荧光检测平台.

多元检测是生物医学分析中的重要方法.实验中通过调节2种不同颜色量子点在硅质体内的荧光强度比，构建多种颜色编码，为多元检测提供编码纳米载体[14].利用传统的预编码方式，通过固定绿色油溶量子点的浓度，改变红色水溶量子点的浓度，制备出绿色和红色荧光强度比为2∶1，1∶1，1∶2的不同编码的量子点/硅质体纳米载体.

量子点表面配体的电荷或组成成分变化会影响核内电子-空穴的再复合，从而影响量子点的发光效率和荧光强度.基于能量转移和电荷转移等机制，某些重金属离子(如Cu2+)在靠近量子点时会导致量子点荧光淬灭[15].根据这一原理，本文提出了一种后编码的方式[16]，通过在预编码方式制备的绿色与红色荧光强度比为1∶2的量子点/硅质体中调控加入Cu2+的浓度，降低红色量子点荧光强度，改变绿色与红色量子点荧光强度比，从而实现对量子点/硅质体的编码.

4　结论

1) 利用薄膜分散超声法制备掺杂25%DSPE的量子点/硅质体纳米荧光载体，粒径约100～150 nm.通过硅质体对量子点的包覆，使双色量子点在保持优异光学性能的同时也提高了抗环境干扰能力，有利于将量子点应用于生物医学分析领域.

2) 利用预编码和后编码方式灵活准确地对量子点/硅质体进行编码，为后续多元检测奠定基础.掺杂带有功能化基团的磷脂DSPE-PEG-COOH，可以在其表面进行纳米组装并构建多功能量子点荧光传感器，在细胞成像方面具有广阔的发展前景.

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