关于脓毒症动物模型建立的基础研究

王 欢，郝舒捷，唐小晓

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622）

脓毒症(Sepsis)是由于感染等原因导致的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)[1]，同时也是人类发生感染后的一种常见症状，而且极其容易引起临床患者的死亡[2]。脓毒性脑病是重症监护ICU（Intensive Care Unit）常见的脑病之一，由于缺少中枢神经系统感染患者的数据证明，一部分专家认为，由全身炎症反应引起的弥散性脑功能障碍是脓毒性脑病，另一部分专家认为脓毒性脑病为脓毒症相关性脑病、中毒性脑病[3]。据调查报告显示，脓毒症的发生每年还在以2%～8%的速率增加，虽然抗感染治疗和脏器支持技术不断进步，但是死亡率仍然高达35%～65%[4]。脓毒性脑病的可能机制有线粒体及内皮功能障碍、直接脑细胞损伤、脑组织中钙稳态变化和神经传递失调等。临床通常使用镇静、肌松等药物，同时结合使用呼吸机进行治疗，这种治疗手段与病人患有影响脑病判断的其他疾病等多种因素有关，在脓毒症的后期阶段，各种器官功能的衰竭可以引发脓毒性脑病。与此同时，某些医源性因素也可以引发脑病。在欧美国家和中东地区，年均大概40万患者死于脓毒症及其并发症，且其治疗费用高达约1600亿人民币，这给每个家庭乃至全社会带来相当大的经济压力。

脓毒性脑病的病理生理过程极为复杂，至今还有很多机制没有阐述清楚，脓毒症的反复发病显示它一直都并未被完全控制。目前针对脑病主要是对症治疗，主要目标是恢复脑功能、控制感染。降低感染率的前提是充分认识引起感染的解剖结构，恢复正常功能，选取有效的药物。脓毒性脑病患者大部分都会出现血脑屏障功能障碍，细胞膜通透性发生改变，致使细胞肿胀，加重脑水肿，于是在维持正常需要的状况下，临床应该严格要求每天输液的多少，同时维持电解质浓度，因为较低的血钙和血镁将会加重脑水肿。在20世纪70年代就有专家提出，给病人注射20%支链氨基酸是可以改善血浆中氨基酸比例失衡，从而减少脓毒性脑病的各种症状[5]。增多血中侧链氨基酸是可以利于介质的促成，同时增进中枢神经系统恢复功能。所以，使用支链氨基酸来治疗脓毒性脑病或许是有效果的[6]。除此之外，一些实验显示，把脓毒性脑病发病的机制作为参考依据来治疗的办法包括针对炎症反应、血-脑脊液屏障和内皮细胞功能障碍、小胶质细胞和星形胶质细胞功能障碍、脑内信号系统的激活[7,8]。由于脓毒症动物模型的应用对推动脓毒症治疗措施的研究起到了非常重要的作用，随着学者对脓毒症的根本原因的更深入了解与研究，脓毒症动物模型正在持续进展中。

研究者们对脓毒症已经做了大量的研究，它的病理生理学的研究进展依赖于各种动物模型。现今，不同种属和各种诱导方法的脓毒症动物模型已经存在[7]，其中小鼠盲肠结扎穿孔术（CLP）模型因成本较低，操作简单等优点被应用最多，盲肠结扎穿孔术可能引起小鼠腹腔内各种细菌的感染，继而急性腹膜炎被诱发，然后导致细菌流入血液，引起全身炎症反应的综合症[8]。因为这个模型可以更加形象的模仿临床脓毒症和多种心脏器官的功能衰竭综合征相关的病理过程，所以被认为是制备脓毒症动物模型的黄金标准。可是，缺乏评价指标和标准化的操作规范是当今CLP模型的一大问题。于是本研究将分析和研究讨论目前存在的动物模型，例如CLP建立小鼠脓毒症模型，从而建立更能形象有效模拟临床实际情况的脓毒症动物模型，设计一个合理的实验方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年雄性C57BL/6J野生(WT)小鼠，小鼠清洁健康，体重在22～30 g，8～9周龄，所有动物实验均以中国科学技术部颁布的实验动物管理条例(1988，No.134)为标准。

1.2 实验试剂和仪器

（1）实验试剂：

十二烷基硫酸钠（SDS）生理盐水（上海邦景实业有限公司）、水合氯醛（上海朗生生物科技有限公司）、葡萄糖（上海弘顺生物科技有限公司）、碳酸氢钠（化学试剂三厂）、庆大霉素（上海恒远生物科技有限公司）、青霉素（上海江莱生物科技有限公司）

（2）仪器：SZ-93自动双纯水蒸馏器（广东瑞沃德）、单臂脑立体定位仪（68001）（新芝生物公司）、XW-80A漩涡混合器（医科大学器械厂）、超净工作台（苏净集团）、超低温冰箱（德国Zeiss公司）、微量移液器（亚荣生化仪器厂）、制冰机DYY-12型电泳仪（日本Sanyo公司）、YX0602型蒸汽消毒器（德国Eppendorf公司）、5417R冷冻高速离心机（亚荣生化仪器厂）。

手术器械：手术刀，组织剪，手术固定板，粗剪刀，眼科镊子，眼科剪，组织镊子，持针器，另外准备1 mL及 5 mL注射器，生理盐水，头皮针，棉签及脑模具等。

1.3 实验方法

1.3.1 常用液体配制

动物实验的常用液体：（配液所需的H2O为三蒸水）1×PBS液：8.00 g氯化钠+0.20 g氯化钾 +1.44 g，Na2HPO4+0.24 g，KH2PO4加 H2O定 量 至1000 mL；0.2 mol/L的PB原 液：5.92 g NaH2PO4˙2H2O + 58.00 g Na2HPO4˙12H2O， 加H2O定量至1000 mL；10 mmol/L的PBS溶液：50 mL 0.2 mol/L PB+9.00 g 氯化钠，加H2O定量至1000 mL；3%水合氯醛：称取0.6 g水合氯醛，用0.9% NaCl注射液溶解定量至20 mL； 人工脑脊液（ACSF）：100mlACSF母液（10×）+1.98 g葡萄糖+2.1 g碳酸氢钠，加水定量至1000mL。

1.3.2 建立小鼠脓毒症模型(CLP动物模型的制备)术前准备

取成年雄性C57BL/6J野生(WT)小鼠15只，分成A组（轻型CLP造模组），B组（重型CLP造模组）和C组（Sham假手术组），每组各5只，同时禁食12 h，但让它们正常饮水。

1.3.3 小鼠脓毒症模型(CLP动物模型的制备)手术过程

对于A组和B组小鼠，首先在腹腔注射3%水合氯醛400 mg/kg进行麻醉，使小鼠进入麻醉状态。接下来小鼠取仰卧位，刮掉小鼠腹部的毛，腹部皮肤用75%酒精消毒[7]，用手术刀在腹白线中点下方约0.3 cm处逐层剪开表皮、肌层和腹膜(切口长度约1～2 cm)，寻找到盲肠，然后将其分离，注意别伤害肠系膜血管。在盲肠长度1/2或3/4的位置用4号无蒂丝线进行环形结扎。然后在盲端末以上约0.5 cm处端，A组使用21号针头(半径0.8 mm)，B组使用18号针头(半径1.2 mm)进行贯通穿孔，从肠内挤出一定量的容物，把盲肠小心放回原处，一定要小心别让肠内容物（粪便等）粘附在手术切口。最后还要利用4号无菌丝线每一层进行缝合关腹。在缝合腹部之前在手术的局部使用一些庆大霉素，在缝合时候消毒要进行缝合的颈部皮肤。对于C组（Sham假手术组）小鼠，仅仅进行开腹游离盲肠，可是并不进行盲肠结扎和穿孔，最后用同样方法进行腹部缝合。

1.3.4 小鼠脓毒症模型(CLP动物模型的制备)手术后处理

给每一只小鼠在皮下注射1 mL浓度为20 mL/kg、温度为37 ℃的生理盐水来补充液体，在肌肉注射青霉素80万U/kg。注意事项：在手术过程中和手术完成之后直到实验动物恢复，可以进行活动前，必须维持动物的肛温在37±1℃。然后便可以观察各组小鼠状态，确认眼周是否有白色脓性分泌物，精神状态，实时监测小鼠各项生理指标（体重，肛温及行为学改变）。

1.3.5 小鼠称重

观察各组小鼠的生理状况并且每天称量一次小鼠的体重，分别记录每组每只小鼠的重量。

1.3.6 心包穿刺术

心包穿刺术是将穿刺针和留置导管置入心包腔，然后抽取心包积液。用这个方法取血，备用于内毒素的检测。

1.3.7 内毒素检测

分别于实验前后后抽取A、B、C三组小鼠的静脉血进行血浆内毒素测定。然后制备血浆，在一次性无菌无热原真空采血管中放入少许无菌抗凝剂，然后用其采取静脉血。用离心机离心1 min，3000 rpm/min，将血浆分离出来，要求在取出后的十分钟之内使用。然后制备待测样品，取血小板血浆样本处理液中，将其混匀，放入70 ℃培养箱，10 min后放入冷却槽冷却。最后便是采用免疫比浊法进行检测。

1.3.8 统计学处理

运用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，各项结果全部用Mean土S.E.M.表示，多组数据进行比较可以采用方差进行分析，同时进行方差齐性检验，当P＜0.05时符合统计学规定，具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 CLP术后小鼠一般观察

CLP术后小鼠精力不旺盛，反应迟钝且行动频率明显降低，后背的毛发立起，肛门处的粪便聚集，尿液浑浊，而且眼睑周围出现了粘稠的脓性分泌物。解剖已经死亡的小鼠，可以发现腹腔内部充满浑浊的渗出液，且肠道黏连。五天以后，活下来的小鼠状态明显开始好转。假手术组小鼠术后恢复了意识显示这一组小鼠恢复了正常状态。

2.2 假手术组小鼠及造模组小鼠体重增长趋势的比较结果

C组（假手术组）小鼠体重明显高于轻型CLP造模组小鼠的体重，这显示了C组（假手术组）小鼠可以正常进食，随时间推移体重稳步上升，而造模组小鼠因为生理状况变差，体内发生严重的炎症反应导致无法进食，随着时间推移导致体重逐渐下降甚至死亡（图1）

图1 假手术组及造模组小鼠体重增长趋势

2.3 假手术组小鼠及造模组小鼠的体重在统计学上的分析结果

C组（假手术组）的小鼠体重明显高于A组（轻型CLP造模组），并且P＜0.01，具有显著的统计学意义（图2）。

图2 假手术组小鼠及造模组小鼠的体重变化图

2.4 假手术组小鼠及造模组小鼠血液中的内毒素含量

为确认CLP是否能够诱发败血症，我们对C组（假手术组）及CLP模型小鼠的血液样本进行了内毒素含量的测量。内毒素浓度的测量的结果显示。与假手术组相比，A组（轻型CLP造模组）的内毒素水平明显增高，并且具有显著的统计学意义（图3）。

图3 假手术组及轻型造模组内毒素检测结果

对正常组及轻型CLP造模组小鼠的血液样本进行了内毒素含量的测量。内毒素浓度的测量的结果显示。与C组（假手术组）相比，在B组（重型CLP造模组）小鼠中，内毒素水平明显增高，并且显著高于A组（轻型CLP造模组）。且具有显著的统计学意义（图4）。

图4 假手术组及重型造模组内毒素检测结果

3 结论

综上所述，与正常组小鼠相比，在CLP处理的模型组小鼠中（mild CLP与severe CLP），内毒素水平均明显增高，并且具有显著的统计学意义（图3，图4）。数据显示我们成功构建了小鼠脓毒症模型。证实了CLP引起的腹膜炎表现出高内毒素水平是伴随着丰富的脓性腹水，肠道明显扩张，表面的多个器官如肝脏和肾脏出血以及肺部水肿。这些观察表明，这个CLP模型是合适的SE的病理生理学的研究。因此，进行后续研究的实验时我们使用的模型是内毒素阳性的CLP小鼠，是真实有效的模型。