D-二聚体在孕早期不明原因复发性流产患者中临界值的探讨

林涛，沈晓露*，潘豪杰，吴雪清

(1.温州市人民医院，温州　325000；2.温州医科大学附属第一医院，温州　325000)

复发性流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指同一个性伴侣连续超过两次妊娠均未成功，即连续遭受 2 次或 2 次以上自然流产或胚胎停育。结局是不能得到正常的有生机的胎儿(28周内)，RSA容易引起继发不孕，给患者带来强大的精神心理压力，严重影响个人、夫妻双方甚至整个家庭的生活品质，对个人、家庭、社会影响较大，是目前生殖领域的研究热点和难点。RSA在育龄期女性中的发病率为1%～3%[1]，其中50%以上原因不明，称为不明原因性RSA(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]。现有研究表明，部分URSA患者会出现血栓前状态(Prethrombotic state，PTS)，导致胎盘小、微血管内血栓形成，胎盘血流灌注下降，较大的影响母体与胎儿之间的物质交换[3-4]，最终引起流产。目前临床上常用的PTS的指标有：D-二聚体的检测，同时行血同型半胱氨酸(Hcy)、活化蛋白C抵抗试验(APC-R)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶Ⅲ(ATⅢ)等检测。

本研究通过大样本的URSA病例，检测代表PTS的D-二聚体的变化，同时联合其它PTS的分子标志物，如Hcy、PT、APTT、APC-R，找到URSA的PTS下D-二聚体的界值，及其它有价值的指标联合预测URSA，指导保胎，减少流产的发生率，并找到PTS的实验室可参考的临界值及参考范围，用来指导低分子肝素(LWMH)进行保胎治疗。

对象与方法

一、研究对象

收集2013年6月至2017年6月在本院妇科就诊的2 975 例患者，其中要求门诊行人工流产术、既往无稽留流产史的早孕患者1 160 例为早孕组(NEP组)；此次为宫内早孕、单活胎、既往有≥2次稽留流产的患者673 例为RSA早孕组(AEP组)；既往有稽留流产史，此次未孕患者1 142 例(ANP组)。AEP及ANP纳入标准为：单胎、无内外科及妇科合并症。排除标准为：(1)生殖道结构畸形：超声或宫腔镜检查子宫畸形，如纵隔子宫、单角子宫等，子宫内膜息肉和子宫黏膜下肌瘤；(2)糖尿病、甲状腺疾病等内分泌异常；(3)感染：弓形体病、风疹、巨细胞性包涵体病毒、疱疹、梅毒(TORCH)阳性，衣原体、淋球菌感染；(4)夫妇染色异常；(5)自身免疫性疾病：抗心磷脂抗体阴性，抗核抗体阳性，系统性红斑狼疮等；(6)血栓史。AEP、ANP、NEP患者检测TORCH、空腹血糖、甲状腺功能及其抗体、抗β2-GP-1抗体、狼疮抗体、子宫B超，绒毛染色体检查(胚胎停育者)等，对照研究。AEP及NEP患者除进行D-二聚体的检测，同时行血Hcy、APC-R、PT、APTT检查。入选所有参加者均告知详细细节并签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会批准。

二、研究方法

1.分组：按本次生育意愿及既往有无不明原因复发流产史，分为NEP组：要求门诊行人工流产术、既往无稽留流产史的早孕患者(1 160 例)；AEP组：此次为宫内早孕、单活胎、既往有≥2次稽留流产的患者(673 例)；ANP组：既往有稽留流产史，此次未孕患者(1 142 例)。

2.样本收集：所有患者均为单胎，AEP及NEP组B超提示宫内单胎，见心搏，即查D-二聚体及其它各指标。ANP组未孕，即查D-二聚体及其它各指标。

3.指标检测：(1)D-二聚体水平检测：采用免疫比浊法、悬浮法、分光光度法吸收测量含乳胶粒子的变化，含有共价包被有抗体的乳胶颗粒悬浮液的混合样品。抗原抗体引起乳胶粒子的凝集反应，可分光光度法测(2)Hcy：通过氧化型Hcy经三乙羧乙基膦(TCEP)还原成游离的Hcy，Hcy和自由基反应，循环放大，通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)+转换成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)后，吸光度检测转化率。(3)APC-R：基于对凝血时间测试的血浆放置在含钙培养基中含有人体活化蛋白C和钙化中的延长。(4)PT：用含钙凝血活酶测定患者血浆凝固时间。(5)APTT：标准数量的脑磷脂(血小板替代物)和特定激活物(硅土)存在条件下血浆的复钙时间。所有患者均行D-二聚体水平检测，AEP及NEP患者除进行D-二聚体的检测，同时行血Hcy、APC-R、凝血酶原PT、APTT检查。

三、统计学方法

采用Graphpad Prism 6.0软件对数据进行统计学分析，采用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)计算界值，界值取敏感性和特异性最大时D-二聚体及其它各项指标的值。两组数据之间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

一、各组患者的一般资料

三组患者的年龄、体重指数(BMI)、孕次数值相近，无显著性差异；与AEP组相比，NEP组及ANP组的基础FSH、抗苗勒管激素(AMH)略低，但差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1　三组患者的一般资料(-±s)

二、AEP和NEP组各指标的比较

AEP组中，D-二聚体的临界值是0.65 mg/L，两组相比有统计学意义(P<0.05)；其中D-二聚体ROC曲线下面积0.89(P<0.01)，对复发性流产有较好的诊断及预测价值(表2，图1)。阳性预测值、阴性预测值分别为90.24%、72.67%。

表2　NEP与AEP患者PTS各指标的比较

注：临界值采用NEP组与AEP组相比较得出ROC曲线下面积

注：AUC为ROC曲线下面积图1　NEP和AEP组D-二聚体和Hcy最佳界值判定的ROC曲线

Hcy、PT临界值分别是9.75 μmol/L、12.85 s，两组相比差异有统计学意义(P<0.05)，而APCR、APTT则无显著性差异(P>0.05)(表2)。

AEP组中PT的AUC为0.55，阳性预测值36.79%(P<0.05)，对RSA有预测价值，其最佳临界值取12.85 s(图2)。NEP与ANP组的PT无显著性差异(P>0.05)(图3)。

图2　NEP组和AEP组PT最佳界值判定的ROC曲线

图3　ANP组与NEP组中PT值的比较

三、NEP与AEP、ANP三组D-二聚体的比较

与AEP组相比，NEP、ANP组的D-二聚体的临界值及95%的区间值均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；AEP组D-二聚体临界值显著大于NEP及ANP组(P<0.05)，但NEP与ANP组之间无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表3　三组患者D-二聚体水平的比较

注：与AEP组相比，*P<0.05

讨　　论

URSA广义上来讲属于不孕症范围，其特殊性是妊娠后连续性的胚胎丢失，而不能得到有生机儿，给个人、家庭及社会以沉重负担，给孕妇沉重的心理负担，对社会危害巨大。URSA病因复杂，但血栓及PTS形成是其共同的病理生理结果之一，导致胎盘内小血栓形成，胎盘血流灌注下降，严重影响母胎之间的物质交换进而引起流产。目前尚无统一检测PTS的实验室指标及PTS的规范化治疗或指南。本文通过对673 例URSA早孕组(AEP)与本次单活胎、既往无稽留流产史早孕患者1 160 例(NEP)进行对比，分析了D-二聚体、Hcy、PT、APTT、APC-R五个PTS指标，发现D-二聚体、Hcy、PT对URSA有预测性，但D-二聚体敏感性及特异性最高，可作为筛查指标；Hcy、PT的敏感性、特异性次于D-二聚体，但二者是否可以作为联合筛查指标仍需进一步验证。而APTT、APC-R作为URSA的PTS筛查指标意义大不。同时对AEP、NEP、ANP三组病例进行分析，发现D-二聚体在三组中的关系是：AEP组比ANP及NEP组高，而ANP与NEP相比则无明显统计学差异。祝丽琼等[5]的研究结果提示URSA患者未孕妇女D-二聚体水平同正常未孕妇女无差别，与上述结论一致。AEP组D-二聚体临界值大于ANP及NEP组，说明URSA患者妊娠后血液进一步进入高凝状态，D-二聚体较URSA未孕状态高。说明D-二聚体水平升高可作为高凝状态判断指标，可用来预测URSA血栓前状态。

D-二聚体是提示PTS和继发性纤溶亢进极其敏感的指标，在URSA中含量显著升高，说明患者存在较为严重的PTS[6]。妊娠妇女，尤其是RSA患者，D-二聚体含量显著高于正常妊娠妇女，提示RSA患者可能存在微血栓或PTS，导致胎盘组织微循环的缺血缺氧，导致血管内皮细胞受损进而导致部分绒毛变性坏死，与此同时，机体启动继发性纤溶活动，以清除子宫静脉窦以及螺旋动脉内的血栓，从而加速再生和修复血管内皮细胞，最终显示出来的是含量明显升高的D-二聚体。同时，对于血栓已形成或有形成倾向，使用LWMH抗凝治疗已得到国内及国际的充分认可，并且D-二聚体可以作为指导肝素使用及抗血栓的监测指标[7]。研究表明，D-二聚体含量在体内升高，表明机体纤溶以及凝血系统均被激活，处于继发性纤溶亢进状态，也是提示体内血栓形成的重要指标之一[8]。

D-二聚体在URSA患者再次妊娠的界值是0.65 mg/L，可以认为在这个范围内，妊娠相对是安全的。超过这个范围，即有使用肝素防止PTS或血栓，进行保胎的必要性。目前临床上公认LMWH用来对URSA血栓前状态进行抗凝保胎治疗，其应用广泛。临床上目前除用常规黄体酮保胎外，对于URSA尚可用LWMH保胎，效果显著，其判断效果的最重要依据之一即是D-二聚体，URSA再次怀孕不加干预再次流产的概率约60%～70%。Tong等[9]对150名合并PTS的RSA孕妇用LWMH抗凝联合阿司匹林保胎治疗，保胎成功率高达84.3%甚至更高。D-二聚体是重要的预测和指导用药指标，可能的原因是LWMH降低孕妇血液高凝状态，减小了血液粘滞度，降低小微血管的阻力，增加了胎盘血流量，改变了宫内微环境，降低组织缺血缺氧，进而促进了胎儿的生长发育，减少胎盘血栓形成。

本研究结果显示：Hcy在RSA产早孕患者中的界值是9.75 μmol/L。本研究结果所获得的Hcy的界值与2006年美国心脏协会公布的“卒中指南”、世界卫生组织出版的第11版《国际疾病分类》、2010年“中国高血压防治指南”中，在防治干预价值、临床检测与诊断、筛查上，10 μmol/L这一水平为高同型半胱氨酸血症(HHcy)阈值[10]，是大致相符的。大量研究证明，体内HHcy是RSA的独立危险因素，其有促凝的功能，超过正常范围浓度的Hcy将导致孕妇出现RSA[11]。Eskes等[12]的研究进一步证实HHcy与流产、宫内生长受限(FGR)、胎盘早剥关系密切，HHcy是胎盘血管疾病的独立危险因素。HHcy同时伴有其他血栓形成危险因素时，胎盘血管疾病导致的RSA的发病风险将成倍增加[13]。HHcy可引起绒毛血管分化发育不良，造成胚胎死亡、流产[14]。HHcy对RSA的影响，除了血管因素，还可能因为血中Hcy含量过高，代谢时消耗大量的一碳单位，影响胚胎的DNA合成，导致流产的发生。另外，Hcy还可提高氧自由基含量，使得代谢紊乱，阻碍胚胎存活、阻碍神经管发育，出现畸形。

上世纪末，Dahlback等[15]报道，在一些血栓或PTS疾病患者中，APTT并未延长，即使加入纯化的活化蛋白 C也无明显变化，这种现象被称为APC-R现象。本研究中APC-R在预测RSA再次妊娠风险时无统计学差异(P>0.05)，即该指标无临床意义(注：本次研究检验过程做过数次质控)。该结果与部分文献结果不一致，一般认为APC-R与RSA存在一定的相关性。董卫红等[16]报道：胎盘部位的血栓形成是APC-R引起流产尤其是晚期流产的重要原因之一。APC-R 患者时常存在高凝状态，妊娠后可短暂获得APC-R升高，提高了血栓形成的风险性。该文献强调APC-R检查结果与晚期流产的关系，而本文着重研究早期妊娠及早期RSA。Ayadurai等[17]发现，血浆中APC-R值经历过孕早期短暂上升以后，从孕 14 周开始逐步减少，到36周减少到最低点，产后 8 周恢复到正常水平。由于APC-R值越低，即加入APC后APTT的延长时间越短，则APC-R的阳性率越高，发生血栓的危险越大，该文献强调14周后APC-R的阳性率上升。故可认为，早期RSA患者孕早期(13周内)APC-R无统计学差异。Pihusch等[18]认为早期反复流产与APC-R无关。本结果与其相一致。

PT和APTT是临床上对凝血功能的常规检查，属于反映凝血系统的筛选试验：凝血因子I、Ⅱ、V、Ⅶ、X的含量及水平表现在PT的值，是临床上最常用的反映外源性凝血路径的筛选方法，血液呈现高凝状态时PT值显著缩短。APTT反映内源性凝血途径中与除第Ⅶ、Ⅷ因子外的所有促凝物质有关[19]。本研究中，PT值在RSA患者再次妊娠中有统计学差异，PT值下降，界值是12.85 s，而在URSA未妊娠患者与正常妊娠患者中，PT值则无明显统计学差异，与黄钰华等[20]的研究一致，他们认为在RSA早期妊娠者的PT值较未妊娠者明显缩短，与妊娠期凝血因子合成增多，形成血液的高凝状态有关。

综上所述，URSA中PTS作为其共同的病理生理结果，其在临床上已达成共识并逐渐得到重视，D-二聚体作为PTS的指标之一，因其无创性、可重复性及敏感性，广泛应用于临床。本研究通过较大样本的URSA病例，检测代表血栓前状态的D-二聚体的变化，同时联合其它PTS分子标志物，如PT、APTT、Hcy、APC-R，得到URSA-PTS状态D-二聚体的临界值，及其它有价值的PTS分子标志物参考值。尝试解决目前临床上PTS的临界值及参考值都是针对正常未孕人群制定的，缺乏URSA的PTS参考范围的局面。本文大样本量的URSA再次早孕患者与正常无不良孕史的早孕人群进行统计学比较，结论是：早期URSA患者D-二聚体水平显著升高，存在血栓形成倾向，D-二聚体检测可预测URSA发生血栓的可能性，改善妊娠结局。URSA再次妊娠早孕期D-二聚体的临界值为0.65 mg/L，可认为排除其它引起高凝状态的病因，这一范围的D-二聚体继续妊娠是相对安全的。

但本研究仍存在一些不足，即未对D-二聚体 0.65 mg/L这一临界值在URSA再次怀孕早期患者中使用LWMH保胎情况进行统计，其在保胎中的应用价值需进一步验证，也是该项研究的下一步思路。另外，目前尚有一些文献及研究发现B超下子宫动脉血流阻力对URSA有提示及预测作用[21]，进一步研究预计增加行B超下子宫动脉血流结合PTS分子标志物预测URSA，希望能指导LWMH进行保胎。

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