秀丽隐杆线虫抗菌药物筛选实验体系的建立

徐阿晶，　马　婧，　黄晓会，　蒋兴浩

(1. 上海交通大学 医学院附属新华医院药剂科， 上海 200092;2. 上海交通大学 电子信息与电气工程学院, 上海 200240)

0　引　言

秀丽线虫,亦称秀丽隐杆线虫，以细菌为食, 其生命周期约为3 d, 平均寿命为3周。成虫体长约1.0～1.5 mm, 体表有一层角质层覆盖物。作为一种模式动物, 已广泛应用于当前生命科学研究的各个领域。

秀丽线虫对各种生物、化学刺激物会产生趋化作用，通过线虫对各种刺激物的反应特性加以鉴别可以实现生物检测。早先的秀丽线虫生物检测研究方法是先使用叠氮化钠将培养基上的线虫麻痹使之少动或者不动，然后再对刺激物所在的培养基材料各个区域中线虫的数量进行计数分析，以判断线虫对不同刺激物产生的趋化作用。但这种方法有很多重复性的人工操作，需要肉眼通过显微镜观察判断线虫是否死亡，耗费很多人力和时间。近年来,国外学者提出了对整个生物活动过程进行测定，特别是秀丽线虫在培养基上活动的详细运动轨迹，例如通过显微镜记录虫体蠕动速度和虫体扭转频率等参数[1-2]。Moy等随后对方法进行了改进，建立了更加微型化和全自动化的高通量筛选系统，该系统主要由复杂对象分类筛选系统COPAS和自动图像获取处理系统Biosort。使用这个系统，可以实现微型化和全自动化的384孔板采集分析的高通量筛选[3]。但此系统价格昂贵，而且上述方法受限于摄像显微镜的数量和视野，通常只能用384孔板的微量培养基做短时间观察，而难以使用其他培养皿进行不同分组之间的秀丽线虫的大面积、长时间观察。

为此，本文采用一种可用于6孔板的多重可视化指标的秀丽线虫药物筛选评估体系，最多可以使用六个高清摄像头同时记录6孔板上线虫活动的轨迹，并用自定义Matlab脚本处理图像。

1　材料与方法

(1) 线虫与菌株。N2 野生型秀丽隐杆线虫(C. elegans， Bristolstrain N2)和大肠杆菌E.coliOP50，铜绿假单孢菌PseudomonasAeruginosa(PA14)由中国科学院遗传发育所杨崇林研究员惠赠。

(2) 试剂。叠氮钠、蛋白胨、琼脂粉、药物等来自 Sgima公司，其余试剂为国产分析纯。

(3) NGM 培养基。1 L的NGM培养基含17 g琼脂， 2. 5 g蛋白胨， 3 g NaCl， 1 mol/LPBS液(pH6.0) 25 mL，入975 mL蒸馏水，灭菌后加入滤膜除菌的1 mL胆固醇溶液( 5 mg/mL乙醇) ， 1 mol/L CaCl21 mL， 1 mol/L MgSO41 mL。

(4) M9缓冲液。1 L的M9缓冲液含15.12 g Na2HPO4·12H2O， 5 g NaCl， 3 g KH2PO4， 0.25 g MgSO4·7H2O。

2　线虫自主活动跟踪记录系统

2.1　机械组件

为了记录、观察线虫的运动，自制了一个摄影灯箱，使用不锈钢板焊接成型，顶部开有6个直径32 mm的观察孔，在观察孔上使用热熔胶固定了6根PVC管，以利于安装摄像头。该观察记录装置由图1所示的304不锈钢板焊接、装配制成，分为上下两层，下层为电源、散热风扇，为箱体光源提供稳定的低纹波直流电源。上层主要由光源、摄像头和6孔培养板组成。上层结构的正中放置6孔培养板，6孔板内含有培养基和秀丽线虫。6孔板侧壁四周围绕一排发光二极管灯带，灯带背面的胶水紧贴不锈钢外壳对外散热，6孔板底部也放置有一块平面光源。由于发光二极管灯带为散射光源，部分光线会散射到6孔板上方造成损失，因此在灯带上方放置了一块中空不锈钢遮光板，中空部分稍大于6孔板的外缘，该中空板可以将散射的光线重新聚集到6孔板的侧壁，引导光线从侧面射入6孔板。

图1观察记录装置的结构示意图

1-观察箱体; 2-摄像头; 3-中空遮光板; 4-侧壁发光二极管灯带; 5-6孔培养板; 6-电源控制模块; 7-散热风扇; 8-底部平面光源

在观察箱的顶部，用不锈钢开孔器开6个直径φ32 mm孔，开孔距离与6孔板的孔距完全一致，取φ(32×1) mm的PVC电工管，截取12 cm左右插入开孔处，用热熔胶枪初步固定PVC管。购买微软LifeCam Cinema HD 高清摄像头，拆除外固定装置后将摄像头插入PVC管中。由于该摄像头具有自动对焦和录音功能，因此其麦克风部分有一定突起，正好卡住PVC管壁固定，缓慢调节摄像头、PVC管高度，使其视野完全覆盖6孔板，此时6孔板培养基距离摄像头约5 cm，摄像头自动对焦后即可成像并开始记录，最后用热熔胶枪将PVC管和摄像头固定完全。

2.2　秀丽线虫观测条件

秀丽线虫成虫的大小约1 mm，虫体为白色半透明状，因此使用传统倒置显微镜观察96孔板时主要通过透射光的折光率差异成像，由于显微镜视野过小，只能观察幼虫，而使用摄像头观察32 mm直径的大视野6孔板时，透射光的观测效果非常差，因此光源部分采用了暗视野技术，在6孔板下方安装黑色的遮光纸，在箱体侧面安装LED灯带，LED灯带的散热面紧贴箱体，通过箱体散热。

2.3　数据采集与分析

线虫被培养在6孔培养板(U型)，根据不同的实验目的加入测试物，然后放入摄影灯箱，开启光源和摄像头，使用计算机录制线虫的的自发活动视频，通常记录24 h或更长时间，并记录活动情况。

使用2个计算机程序分别用于记录和分析视频，记录软件选用Debut Video Capture Software Professional,分析软件采用自主编写的LabVIEW以及MatLab脚本进行视频分析，提取线虫的活动记录信息。

2.4　实验测试

2.4.1培养条件

秀丽隐杆线虫细菌感染方法。从成虫分离虫卵，在M9缓冲液中孵化过夜，得到L1 期幼虫，将幼虫转移到NGM培养基的E.coli菌苔上在20 ℃培养箱中继续生长48 h，用M9缓冲液洗脱虫体并反复清洗后，将虫体分别转移到普通琼脂平板的铜绿假单胞菌的菌苔上，在20 ℃培养箱中培养8 h进行感染，感染后转移到6孔板的M9缓冲液中 (缓冲液中加入25 mol/L 5-氟脱氧尿苷(5-FUDR)，以防止自我繁殖) 继续培养，观察记录每日死亡情况。培养板边缘用胶带密封，以防止干燥，系统可记录线虫自发活动超过21 d。

2.4.2视频记录装置的环境控制

由于线虫合适的生存温度为12～22 ℃，最佳培养温度为18 ℃，视频跟踪记录装置的温度控制显得尤为重要。上述装置的电源部分带有散热风扇，适当措施后实测观察箱内温度(17±2) ℃，达到线虫培养的理想温度。 6孔板的外面在记录前应喷涂防雾液并干燥成膜，以防止培养基水分蒸发凝结造成视频图像模糊。

3　结　果

3.1　线虫运动轨迹的观察

微软摄像头自带的记录软件能够以30帧/s的速率记录高清运动图像，因此选用了自带核心显卡的Intel i5-2400处理器的笔记本电脑作为记录硬件。线虫在培养基中的移动速度是缓慢的，而且考虑到USB总线的带宽以及CPU视频压缩能力，记录线虫运动轨迹并不需要那么高的帧率，特别是以30帧/s默认帧率存储的视频文件体积较为庞大，因此我们使用了录像软件Debut Video Capture Software Professional进行记录。选择合适的分辨率960×720， Change Frame Rate设置为5帧/s。图2显示的是本观察箱采集线虫运动轨迹原始录像截图。其中存活的线虫与死亡的线虫在形态方面有明显差异，存活的线虫形态多为S型游动的正弦状态，死亡的线虫形态多为直线型僵直状态(见图 2)。

(a) 存活的线虫运动形态截图

(b) 死亡的线虫

3.2　视频分析用软件

采用自主编写的LabVIEW以及MatLab软件进行，提取线虫的活动记录信息。自动分析计算线虫的成活率，及组间的差别(见图3)。

图3　软件自动分析计算线虫的成活率

3.3　铜绿假单胞菌感染对秀丽线虫生存的影响及药物的治疗效果

图4　　　　美罗培南对铜绿假单胞菌感染引起的秀丽线虫死亡具有保护作用

从图4可以看到，秀丽隐杆线虫被铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosa，PA14)感染1d后没有发现死亡，随后开始出现死亡，多次实验表明，被铜绿假单胞菌感染后的线虫均在7d内死亡。我们的初步实验结果表明，与OP-50菌处理的线虫相比，铜绿假单胞菌感染线虫的生存期限明显缩短(见图4)。而美罗培南(100 μg/mL)治疗，可以明显改善铜绿假单胞菌感染的线虫的生存时间和生存率。

4　讨　论

秀丽隐杆线虫是近20年新兴的模式动物，与传统模式动物相比，秀丽线虫全基因组测序已经完成，遗传背景非常清楚；线虫生命周期短(从虫卵发育到成虫只需要53 h)，通过直接注射外源DNA的方法在很短时间内就可以获得转基因线虫；而且通过简单的喂食方法进行RNAi就能敲除基因。而且，秀丽线虫可以像培养细胞一样储存在-80 ℃冰箱或液氮中，这就为大量保存和使用各种遗传背景的秀丽线虫株系提供了极大的便利。这些特点使得秀丽线虫的细菌感染模型存在着基因操作简单快速，准确度高、费用低廉，特别适合用于大规模药物筛选等许多优点。近年来已较多地被用于抗菌药物筛选，以及对特定病原菌毒力基因/毒力因子/与宿主相互作用/及致病机制方面的研究[4-9]。

近2年来，以CRISPR/Cas9为代表的最新的基因组编辑技术已广泛应用于秀丽线虫的基因组靶向改造，成为后基因组时代的功能基因组研究、疾病模型建立以及基因治疗等不同领域研究与应用的利器[10-15]。由于秀丽线虫模式动物本身具有的各种特性，比如遗传背景清晰、基因操作简单快速、可在显微镜下直接进行基因的表型分析及表达部位分析，生命周期短，很容易冻存和复苏转基因线虫及突变线虫等等[4-9]，所以CRISPR技术在秀丽线虫上的应用可谓强强联合，具有强大的应用开发前景[9-15]。

而另一方面，使用秀丽线虫进行大规模的药物筛选，却始终存在人力耗费大的缺点，如果使用全进口的秀丽线虫自动计数和分选系统，价格非常昂贵，本课题组试制观察箱光源从侧面射入，关闭底部背景光源并用黑纸垫于6孔板下方，制作黑色背景的时候线虫对比度可以大幅提升，观察箱光源选用12 V直流供电的LED灯带，排除频闪干扰；灯箱内壁喷黑漆，减少箱内杂散光散射；φ(32×1) mm的PVC管、摄像头的正面部分涂黑漆，避免摄像头、PVC管倒映在培养基的表面上形成镜像干扰。摄像头选用带有自动对焦功能的光学玻璃镜摄像头，获得最佳观测效果。使用摄像头录像软件Debut Video Capture Software Professional进行记录，以5帧/s默认帧率记录存储。

现有的线虫培养技术主要以LB培养基为基础，6孔板由于线虫数目多，对培养基的透明度要求高，难于实时观察计数。本研究在半透明培养基配制时适当更改配方，减少半透明物质如蛋白胨的用量，并过滤除去杂质。经上述多项参数优化措施，可实现对6孔板中线虫的运动轨迹进行清晰、连续地采集记录。并可以实现对线虫长时间、大范围运动轨迹自动化统计分析。

本研究组基于Matlab编写的图像处理程序，主要用于提取线虫的运动活跃程度的数据，包括存活与否的判断、虫体扭动频率，虫体累计移动路程，以及线虫存活率的自动统计。本文通过对秀丽线虫行为模式的视频内容进行采集、记录、智能理解与统计分析，建立病原菌/药物/生物体三位一体的多重视频指标的耐药菌敏感的药物筛选评估研究体系。

5　结　语

本研究建立的秀丽线虫抗菌药物筛选评估研究体系，可应用于抗菌药物的快速简便筛选，及相应的作用机制研究，具有较好的前景和临床应用价值。

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