异养产油微藻筛选及其在盐胁迫下的油脂累积特性研究

崔 伟，徐晶萍，芦文城，苏晓晨，高 锋，鲍静姣，郭远明

(1.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021)

随着生产的发展，能源需求量急剧增加，化石燃料消耗殆尽，开发可再生的清洁能源以维持生产生活迫在眉睫。生物柴油因不含石蜡，闪点高，燃烧性能和和效率高于普通柴油，可再生等优势，被视作化石能源的理想替代品[1]。在诸多生产原料之中，微藻因培养周期短，产油效率高，油脂质量好，培养过程可不占耕地，并可实现一年四季培养等优点[2-3]，成为新能源开发的研究重点之一。

微藻的培养方式有自养和异养两种。光自养培养方法简单，适用范围广，但培养时需要维持光照条件，且藻液密度升高到一定值会抑制微藻的生长[4]，不利于大规模生产。相比之下，异养微藻的培养不需要维持光照条件，培养密度更高，培养过程中的可控性明显优于自养培养[4-6]，且有研究表明，异养培养的微藻油脂含量明显高于自养培养的微藻[7-9]。因此，就生产生物质能而言，对异养微藻的研究更具有实际意义。

如何在微藻生长的同时同步提升微藻的油脂含量从而提高系统油脂总产量是目前国内外微藻油脂生产领域研究的热点[10-12]。微藻的油脂累积受培养条件、自身生长状态等多方面因素的影响。传统提高微藻油脂含量的方法是氮缺乏异养培养。氮胁迫可以促进微藻体内油脂含量的增加，但也会抑制微藻的生长，导致其生物量减少[13-15]。盐度也是影响藻类生长繁殖的重要因素，近年来有人采用盐胁迫的方法成功提升了自养微藻体内的油脂含量[16]，而对于微藻异养培养则还缺乏这方面的研究。

本次实验从污水处理厂等水体中筛选获得了异养微藻，通过实验优选了该藻株异养生长的优势碳源，并在此基础上进行不同盐度的胁迫培养实验，根据微藻的生长量和油脂含量得出异养产油微藻在盐胁迫下的油脂累积特性。研究成果对于微藻生物能源的发展具有一定的理论价值和实际意义。

1 材料与方法

1.1 藻样采集及筛选

从污水处理厂、天然水体及养殖厂废水中采取水样，过滤后接种于TAP及BG11培养基中进行富集培养。然后经过3次平板划线分离得到纯化藻株，编号为w1-w14，以不含有机物的TAP培养基为自养培养基，以添加了10 g/L葡萄糖为碳源的TAP培养基为异养培养基，分别进行所得微藻的光自养和光异养培养，通过对比微藻的生长量筛选有异养生长优势的藻株，其中w11表现出了最佳的异养生长能力，对w11通过光学显微镜进行形态观察，初步鉴定为小球藻Chlorella vulgaris。

1.2 碳源对微藻异养生长的影响

以不含有机物的TAP培养基为基础培养基，分别添加10.0 g/L的葡萄糖、甲醇、乙醇、无水乙酸钠、六水丁二酸钠为有机碳源配制异养培养基，研究不同有机碳源对筛选的异养优势藻株w11生长的影响，根据其生长量和油脂产量挑选出优势碳源为葡萄糖。实验过程设3组平行样。

1.3 盐胁迫培养

以优选的葡萄糖为有机碳源，对w11进行盐胁迫培养。设置盐度(NaCl质量百分数)为0%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%。根据不同盐度下藻的生长量、油脂含量及油脂产量，得出在盐胁迫下藻株的油脂累积特性。实验过程设3组平行样。

1.4 培养条件

本实验微藻的培养在250 mL锥形瓶中进行，每次培养液体积均为150 mL，培养温度维持在25～30℃，光照条件为60～85 μmol/(m2·s1)。为便于研究微藻自养生长与异养生长的差别，本实验中微藻的异养培养采用光异养培养的方式进行，除添加有机物外，其余条件均与自养培养相同。

1.5 分析测定方法

1.5.1 微藻生长量的测定

采用分光光度法测定微藻浓度具有用量少且操作方便等优点，本实验通过干重法准确确定了不同稀释度的藻液浓度，对照其在680 nm波长处的吸光度[17]，绘制了藻密度-OD680标准曲线，方程为：

1.5.2 微藻油脂累积量的测定

本实验中微藻油脂含量的测定采用磷酸香草醛显色法，磷酸香草醛溶液：0.6 g香草醛加入到10 mL无水乙醇与90 mL蒸馏水的混合溶液中，振动，再加入400 mL浓磷酸，均匀后存放于暗处。

样品测定：取100 μL样品，加2 mL浓硫酸，100℃加热10 min，再水浴冷却5 min，加5 mL磷酸香草醛溶液，37℃水浴15 min，测定OD530。

用油茶籽油溶于氯仿做样品测定油脂含量，绘制油脂含量-OD530标准曲线，每100 μL藻液中的油脂含量为：

油脂含量(mg)=0.123 1×OD530+0.002 8(R2=0.999 9)

结合1.5.1部分测定的微藻浓度，从而计算出微藻中的油脂含量(%)。

1.6 数据分析处理

数据分析采用SPSS 16.0软件，采用配对样本t检验分析试验数据的显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 异养藻种的筛选

从图1可以看出，藻株w3，w6，w8和w11在培养过程中的异养生长量均超过自养生长量，表明它们均具有一定的异养生长能力，其中w3和w6的自养生长量较低，表明它们对于不含有机物的TAP培养基的适应能力较差。另外，w11的异养生长量远高于自养的生长量，并且其最终获得的藻浓度达到了2.0 g/L，远高于其他的藻株，所以选择w11为异养优势藻株。

图1 不同藻株的光自养和光异养生长量对比Fig.1 Autotrophic and heterotrophic growth of different algae strains

2.2 碳源对微藻异养生长的影响

图2对比了优选的藻株w11在添加了不同有机碳源的异养培养基中的生长情况。从图2可以看出，经过17 d生长以后，微藻在以葡萄糖为碳源的异养培养基中生长最为迅速，最高生物量达到了1.63 g/L，其他碳源条件下的微藻生长量没有较大差别，均在1.0 g/L左右(表1)，对比图2中的生长曲线可以发现在微藻的生长前期，5种有机碳源作用相似，而在培养的后期，以葡萄糖为碳源的微藻生长优势逐渐变得明显，在第17天左右达到稳定期；而在其他4种碳源环境下的微藻基本在第10天左右就达到了稳定期，说明葡萄糖做为有机碳源时延长了微藻的生长期，从而获得了更高的微藻生长量。

图2 不同碳源环境下微藻的生长曲线(n=3)Fig.2 Microalgae growth under different carbon source(n=3)

另外，实验过程中对微藻在不同有机碳源下生长的油脂累积量进行了测定，结果见表1。由表1可知，在以葡萄糖为有机碳源的异养培养基中，微藻在获得最高生长量的同时也累积了最高的油脂含量(35.96%)。结合微藻生长量，可以计算出微藻在以葡萄糖为有机碳源的培养基中生长获得的油脂产量达到了0.57 g/L，是其他有机碳源下微藻油脂产量的3倍左右。因此，葡萄糖被优选为该藻株异养生长的理想有机碳源，进行后续的盐胁迫生长实验。

表1 不同碳源条件下藻的最大生长量Tab.1 The biggest biomass under the conditions of different carbon sources

2.3 盐胁迫下的油脂累积

微藻在不同NaCl盐度异养培养基中的生长情况如图3所示。从图3可以看出，当培养液中的NaCl盐度为0.4%时，微藻生长几乎不受培养基盐度的影响，培养结束后获得的微藻生长量与不添加NaCl的培养基中的生长量极为接近(表2)。随着培养液中盐度的进一步提升，培养过程中获得的微藻生长量随着培养液盐度的上升而逐渐降低(表2)，表明微藻的生长逐渐受到了明显的抑制作用。另外，由表2中的数据可见，当培养液盐度上升至2.0%的较高水平时，培养过程中仍然取得了较高的微藻生长量(0.98 g/L)，表明筛选的藻株具有较好的耐盐性能。

图3 不同盐度胁迫下微藻的生长曲线(n=3)Fig.3 Microalgae growth under different salt stress(n=3)

表2 不同盐度胁迫下藻的生长量、油脂含量和油脂产量Tab.2 The biomass yield,lipids content and lipids yield of microalgae under different salt stress

在培养结束后，对微藻的油脂含量进行了测定，并计算了相应的油脂产量，结果如图4所示。从图4可以看出，除盐度为0.4%的培养基以外，微藻在含盐培养基中异养生长时出现了明显的油脂累积现象，培养结束后获得的油脂含量均明显高于在不添加NaCl的培养基中生长的微藻的油脂含量，并且油脂累积量呈现随着培养液盐度上升而逐渐上升的趋势。当培养液盐度上升至2.0%时，微藻盐度累积至47.75%的较高水平，达到了生长在不添加NaCl培养基中微藻的油脂含量的1.6倍(由表2中数据计算)，表明通过一定的盐度胁迫将微藻的油脂含量提升了60%左右。

图4 不同盐度胁迫下微藻的油脂含量和油脂产量(n=3)Fig.4 The lipids content and lipids production of microalgae under different salinity stress(n=3)

对比图3和图4可以发现，微藻的生长速率与油脂累积之间存在一定的关联，微藻在低盐度环境下生长时生长速率较快，所获得的生物量较大，但相应的油脂累积含量较低，随着盐度的增加，微藻的生长逐渐受到了明显的抑制，从而累积了更高的油脂含量。这一发现与文献中采用氮缺乏胁迫方法促使微藻油脂累积的现象较为相似，在促使微藻进行油脂累积的同时，微藻生长速率会明显降低，从而使最终获得的油脂产量无法获得提升[18]。本实验中，微藻在较高盐度下生长时虽然累积了更高的油脂含量，但最终获得的油脂产量均略低于不含NaCl的培养基中的油脂产量(图4)。

本实验的研究结果表明，盐度对于提高微藻的油脂含量具有明显的促进作用，但由于盐度对微藻生长的抑制作用，最终油脂产量并没能提高。这一现象与王涛等[19]的研究结果较为一致，其原因可能为，在盐度胁迫环境下，藻细胞内的活性氧增多，当有限的抗氧化酶无法及时清除活性氧时，细胞油脂的过氧化就会对藻细胞造成一定损伤，从而影响到微藻细胞的生长[19]。所以，利用盐度胁迫提高油脂累积一定要控制好盐浓度。如何在促使微藻进行油脂累积的同时提高最终的油脂产量将是后续研究的重点。

3 结论

本实验通过筛选获得1株以葡萄糖为优势碳源能进行异养生长的小球藻。对其进行盐胁迫处理以后能显著提升其油脂含量，培养的微藻体内的油脂含量随着培养液盐度的上升而逐渐上升，培养液中NaCl盐度达到2.0%时可使微藻的油脂含量提升约60%左右。由于盐度胁迫在促进微藻进行油脂累积的同时也抑制了微藻的生长速率，因此，最终获得的油脂产量并没有增加。可见盐胁迫方法存在与文献中氮缺乏胁迫促使微藻累积油脂等方法相似的问题，需要后续研究继续探索。