三磷酸腺苷二钠氯化镁对宫内窘迫胎鼠脑保护作用的研究

张陈彦，都治香，祁美玉，赵敏英，张铭娜，张立新，安雪丽

（1.石家庄市第一医院产科，河北石家庄 050011；2.河北医科大学第一医院妇产科，河北石家庄 050000）

新生儿缺氧缺血性脑病是新生儿死亡最常见的原因，一些幸存者可能会遗留严重的长期的神经性残疾，包括脑瘫和神经发育延迟。新生儿脑缺氧损伤的严重程度与受多个保护性或有害因素的相互作用结果密切相关。但导致这些调控因素的原理机制还不完全明白。动物实验及临床研究已证实，缺氧缺血可造成神经元死亡。对缺血缺氧的干预，可减少缺氧缺血后的脑损伤。围产期的缺血缺氧对新生儿脑损伤的预后有至关重要的影响［1］。但治疗胎儿缺氧导致的新生儿大脑缺氧缺血性脑病仍然遥遥无期。本研究的目的是制备宫内窘迫胎鼠模型调查三磷酸腺苷二钠氯化镁对缺血缺氧性脑损伤脑细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型的分组和建立 取同批成年雌性Sprague-Dawley大鼠15只，孕鼠随机分为缺血缺氧再灌注组（I／R组）和假手术（Sham组）、三磷酸腺苷二钠氯化镁治疗组（T／M组）三组，每组各5只。于妊娠第19天以3.5%水合氯醛（1 mL／100 g）腹腔注射麻醉，通过无损伤动脉钳钳夹双侧子宫、卵巢血管20 min建立缺血缺氧宫内窘迫模型。T／M组缺血前30 min，45 mg·kg-1三磷酸腺苷二钠氯化镁腹腔注射，Sham组和I／R组于相同时间给予同等体积的0.9%氯化钠注射液。Sham组只进行开关腹手术，不钳夹子宫卵巢动脉。各组孕鼠缺氧20 min后拆除动脉夹以恢复血供，并逐层关腹。各组均于手术后24 h取标本。

1.2 方法 各组均于关腹后24 h剖宫取胎，先确定胎鼠是否存活，点清死胎数，在每组存活胎鼠中随机抽取10只断头取脑，剥离头皮，沿前囟剪开颅骨，取全脑标本。于视交叉起始向尾侧，冠状切面厚2mm，标本置于4%多聚甲醛浸泡24 h经乙醇脱水后用石蜡浸泡并制成蜡块。据大鼠脑立体定位图谱，取丘脑中1／3平面，水平冠状切片厚5μm，制成石蜡切片。

1.3 指标检测 于术后24 h以3.5%水合氯醛对孕鼠行腹腔麻醉，开腹并暴露双侧子宫，观察宫腔内的活胎数，剖出胎鼠并观察存活新生鼠皮肤颜色、四肢运动等情况。计算胎鼠死亡率。取胎鼠，断头处死，取出完整胎脑，于4%多聚甲醛固定48 h，经脱水透明后石蜡包埋切片，备用。

取胎鼠脑组织，滤纸拭干，称质量后，加入4℃的HEPES缓冲液中，其体积是脑组织块质量的9倍，用玻璃匀浆器制成匀浆，匀浆液以3 000 r·min-1离心15 min，分装于-70℃冰箱中保存备用。按试剂盒说明书，利用分光光度计检测胎鼠脑组织的丙二醛（MDA）水平。MDA试剂盒，购于南京建成科技有限公司。

固定后的组织分置于40 g·L-1多聚甲醛中4℃后固定，常规脱水，石蜡包埋后切片，脱蜡，行HE染色，光学显微镜下观察各组织形态学改变。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料以表示，多组间比较为单因素方差分析＋LSD-t检验。计数资料以例数及率表示，比较采用整体＋分割χ2检验。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胎鼠死亡率 I／R组胎鼠死亡率23.31%，明显高于 Sham组（p＜0.05），T／M组胎鼠死亡率15%，较I／R组显著降低（p＜0.05）。见表1。

表1 各组胎鼠死亡率

2.2 胎鼠脑组织MDA表达 与Sham组比较，I／R组胎鼠脑组织MDA含量显著增高（p＜0.05），但T／M组胎鼠脑组织MDA活性显著降低（p＜0.05）。见表2。

表2 各组胎鼠心组织中MDA的变化

2.3 脑组织HE染色病理学变化 光镜下Sham组细胞层次清晰，脑细胞完整，细胞形态正常，未见明显损伤性改变（见图1）。T／M组细胞排列紊乱，组织疏松水肿，神经细胞及胶质细胞变性（见图2）。I／R组可见细胞结构层次紊乱加重，细胞水肿组织疏松水肿更加严重，细胞皱缩，核浓缩，胞质内核碎片，尚可见单个圆形凋亡小体，还有部分坏死病灶，周围可见炎性细胞浸润（见图3）。

图1 Sham组病理图（HE×10）

图2 T／M组病理图（HE×10）

图3 I／R组病理图（HE×10）

3 讨论

妊娠期缺氧是影响胎儿发育和增加新生儿发病风险的常见原因。围产期新生儿脑损伤是缺氧缺血性脑病最常见的原因［2］。缺氧缺血性损伤影响胎儿或新生儿的中枢神经系统发育［3］。虽说缺氧缺血性脑病的发病机制尚不明确，但近年来的研究表明，不良宫内环境可能造成脑发育异常［4］。缺氧是宫内创伤中一种常见形式，和胎儿在经历长时间各种可能缺氧的条件密切相关，包括在高海拔地区怀孕、妊娠合并贫血、胎盘功能不全、脊髓压迫、先兆子痫、合并心脏、肺和肾脏疾病、或血红蛋白病等。研究表明，胎儿缺氧影响新生儿正常的大脑发育和导致各种的神经功能缺损［5］。

新生儿缺血缺氧性脑病的发病机制复杂，一般认为，脑能量代谢障碍、氧自由基损害、钙离子失衡及兴奋性氨基酸毒性作用是引起缺血细胞死亡的关键环节。三磷酸胞苷二钠是一类腺苷酸药物，对神经细胞内的核酸、磷脂及蛋白质等成分的合成及代谢有促进作用，能调节神经细胞的生物膜合成，使神经细胞的抗损伤能力增强，还可营养神经细胞，使神经细胞的凋亡速度得以延缓［6］。镁，称为“高能离子”是细胞内第二个最丰富的阳离子，超过300种酶的辅因子，其中一些催化氧化磷酸化，激活能量储存和代谢ATP。此外，镁离子参与细胞膜的调节渗透性和动脉压。可能因细胞内ATP和ADP存在镁复合物和ATP酶需要镁作为辅因子，氯化镁能增强三磷酸腺苷的作用。

各种不利的循环条件下如低血容量休克、局部缺血和败血症等各种损伤中，给予外源性的三磷酸腺苷二钠氯化镁能够改善亚细胞、细胞或器官的功能，纠正或改善动物休克后的生存率［7］。三磷酸腺苷二钠氯化镁能够提高第二信使cAMP和IP3的基础水平，在出血性休克时降低其在膜信号传导过程中的损伤。因此，发生失血性休克时经三磷酸腺苷二钠氯化镁处理对细胞膜功能的有有利影响［8］。在缺血缺氧的状态下，心血管系统会改变心率，心输出量重新分配，以保护有限的能源资源，保持大脑足够的能量供给［9］。且三磷酸腺苷二钠氯化镁对脊髓损伤有保护作用［10］。镁离子还可促进氧与产妇和胎儿血红蛋白的结合，提高子宫胎盘的血流速度，从而提高产妇与胎儿之间的物质交换，提高胎盘的功能［11］。ATP对缺血缺氧损伤的保护作用机制是三磷酸腺苷二钠氯化镁可以直接提供对细胞内钠离子的能量或能量底物-钾-ATP酶以及钙-ATP酶保留在细胞外和细胞内的离子平衡，减轻细胞内酸中毒和细胞肿胀。此外，三磷酸腺苷氯化镁也对微循环的改善效果，修复膜的电压，恢复正常膜的渗透性和细胞功能的改进［12］。氯化镁的二价阳离子抑制ATP的螯合作用，并且抑制ATP的脱氨基作用和去磷酸化，从而维持组织的高ATP水平。围产期脑损伤后细胞凋亡较显著。由于三磷酸腺苷二钠氯化镁的神经保护作用，可以降低新生儿缺氧缺血脑病的风险。

本实验中 I／R组胎鼠死亡率明显高于Sham组，T／M组胎鼠死亡率较缺血缺氧组显著降低，从而证实三磷酸腺苷二钠氯化镁可以降低宫内窘迫胎鼠死亡率，提高存活率。本研究病理组织学结果提示，光镜下Sham组细胞层次清晰，脑细胞完整，细胞形态正常，未见明显损伤性改变。无水肿，无核浓缩，无核碎片，凋亡小体少见，并且未见坏死灶。I／R组可见细胞水肿，细胞皱缩，核浓缩，胞质内核碎片，尚可见单个圆形凋亡小体，还有部分坏死病灶，周围可见炎性细胞浸润；T／M组上述现象明显减少、减轻。提示三磷酸腺苷二钠氯化镁在减轻宫内窘迫胎鼠脑组织损伤方面有明显的保护作用。

三磷酸腺苷二钠氯化镁降低缺血再灌注过氧化产物，从而减弱线粒体的脂质过氧化作用，达到清除氧自由基的功能［9］。而组织中MDA水平可用于测定组织中的氧化应激状态，是反映自由基损伤程度的重要指标［13］。本组实验的结果提示，与Sham组比较，I／R组胎鼠脑组织MDA含量显著增高，但T／M组胎鼠脑组织MDA活性显著降低，提示三磷酸腺苷二钠氯化镁能够减少MDA生成，从而减轻组织的脂质过氧化损伤，减轻宫内窘迫胎鼠脑损伤方面有明显的保护作用。此理论提示三磷酸腺苷二钠氯化镁可以是治疗新生儿缺氧缺血性脑病的选择。这种疗法应进行确认的临床疗效研究论证。

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