仿生态栽培金线莲的指纹图谱与微量元素研究

张海燕

(福建省邵武市林业科技推广中心，福建 邵武 354000)

金线莲(Anoectochilusroxburghii)是一种名贵中药材，具有较高的保健与药用价值。随着市场需求的不断扩大和野生资源的日益枯竭，组培和大棚种植成为商品金线莲的主要来源[1]。由于人工培育金线莲品质较低，仿生态栽培金线莲应运而生。通过模仿原生境的栽培模式，提高金线莲药用品质，可以满足“道地性”要求[2]。虽然已有多种中草药的仿生态栽培获得成功，但金线莲仿生态栽培还处于尝试阶段。目前，仿生态栽培金线莲的药用品质还不明确，无法与组培和大棚栽培金线莲进行准确的比较，这在一定程度上影响了金线莲仿生态栽培模式的推广应用和市场价格[3-5]。

长期以来，金线莲的品质一般采用黄酮、氨基酸和多糖等指标进行评判，难以反映中成药中的复合成分及其综合药理机制[6]。近年来，化学指纹图谱技术被应用到中药品质评价领域，结合多种分离技术的运用和多元统计分析，能够较为全面地评价中草药质量[7]。另外，微量元素是中草药的重要组分，其含量及比例的高低直接影响中成药的生物活性[8]，如中药药效成分天麻素活性与微量元素含量具有明显相关性[9]，当归头、身、尾分用异效与微量元素含量差异密切相关[10]。目前，有关利用指纹图谱和微量元素对金线莲进行品质分析的研究很少。本研究通过测定仿生态栽培过程中金线莲HPLC指纹图谱和微量元素含量变化，比较不同来源金线莲品质差异，可为金线莲仿生态栽培、金线莲品质判定和制定仿生态栽培标准提供参考。

1　材料与方法

1.1　仿生态样地设置与样品采集

种植区位于邵武市二都国有林场，依据金线莲生长习性及其野生林地特征，选择以米槠为主的天然常绿阔叶林为栽培种植区。在林内选择腐殖质丰富、土壤湿度较高的区域，设置5 m×5 m的种植样地(种植密度约为160株·m-2)5块。

于2016年4月移栽金线莲组培苗(福建金线莲尖叶种)，除模拟降雨喷灌及适度遮荫外，无其它人工干预措施。并于当年5月、6月、7月、9月共采集4批次金线莲样品(按时间顺序分别记为S1、S2、S3、S4)。同时在邵武野外采集与仿生态栽培同一品种的野生金线莲样品(生长1 a左右，记为S5)，另在市场上采购同一品种的成品大棚种植金线莲样品(生长240 d左右，记为S6)和成品组培金线莲样品(记为S7)。样品采后进行烘干处理，研磨后用于指纹图谱和微量元素的测定，并采集样地的表层(0～20 cm)土壤，烘干、过筛后用于测定微量元素。

1.2　指纹图谱的分离

将金线莲粉末用80%甲醇提取后通过高效液相色谱仪(安捷伦1260)分离金线莲指纹图谱，色谱柱使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，色谱分离条件依据文献[10-11]的方法，并做一定调整，检测波长256 nm;流速1 mL ·min-1；柱温25 ℃；进样量20 μL(表1)。

1.3　微量元素的测定

采用硝酸-高氯酸法消解植物样品[12]，然后利用 ICP-OES测定所有样品中的B、Mn、Fe、Sr、Zn、Li的含量[12]，每个样品设3次重复。

表1　色谱条件

1.4　数据处理

用中药色谱指纹图谱的相似系统(2004 A版)计算软件绘制色谱图，用Excel 2007、DPS 7.5和SPSS 22.0等软件对数据进行标准化处理和聚类分析。

2　结果与分析

2.1　金线莲指纹图谱分析

不同仿生态栽培时间和不同栽培方式金线莲的指纹图谱见图1。从图1可以看出，随着仿生态栽培时间的延长(S1-S4)，金线莲指纹图谱发生了较大变化，以2、3、4、5、6、7、8号位的峰形变化较为明显，至仿生态栽培150 d后，上述峰形面积大幅增长，并最终与野生金线莲谱图类似。表明仿生态栽培改变了金线莲中的有机组分，最终成分趋近于野生金线莲，仿生态栽培对金线莲品质提高较为有效。仿生态栽培期间的金线莲指纹图谱变化较为复杂，但栽培100～150 d后其指纹谱图逐步接近野生金线莲，说明这一时期为仿生态金线莲品质变化的关键期。栽培150 d后谱图与野生金线莲最为相似，表明仿生态金线莲的各有机组分比例与野生金线莲类似。

图1　不同金线莲样品HPLC指纹图谱

进一步比较组培、大棚种植、仿生态栽培150 d和野生金线莲指纹图谱可以看出，仿生态栽培150 d和野生金线莲的指纹图谱与其它栽培模式间存在明显区别，其中1、2、3、5、6、7、8号位色谱峰面积差异显著，说明尽管不同栽培模式下获得的金线莲中化学组分相似，但比例不尽相同。结合各时期仿生态栽培金线莲指纹图谱分析结果，2、3、4、5、6、7号位的色谱峰可提供仿生态金线莲品质判断参考，除了野生金线莲，它们在其它样品中含量比例均更低。

2.2　金线莲微量元素含量分析

不同栽培方式下金线莲中微量元素含量情况见表2。从表2可以看出，所有样品中的微量元素含量均符合国家食品安全卫生标准。仿生态栽培金线莲中各种微量元素含量随栽培时间延长而增加，至仿生态栽培150 d，除了B元素外，最终含量都接近或超过野生金线莲的水平。不同栽培方式的金线莲中微量元素含量差异较大，除了B、Li和Mn外，其它元素均以野生金线莲中含量为最高。且以Fe元素含量差异最显著，野生金线莲中Fe元素含量可达组培和大棚种植金线莲的10倍以上。上述结果表明，金线莲中微量元素含量与其生长基质密切相关。仿生态栽培能够改变金线莲中微量元素比例，其最终含量比例与其生物学特性和土壤性质有关。

表2　不同金线莲样品微量元素含量　mg·kg-1

图2　不同金线莲样品色谱图聚类图

2.3　指纹图谱和微量元素的聚类分析

图3　不同金线莲样品微量元素聚类图

指纹图谱聚类分析结果见图2。从图2可以看出，仿生态栽培30 d金线莲与组培苗最为接近；仿生态栽培60 d金线莲与大棚种植金线莲近似；仿生态栽培150 d金线莲与野生金线莲最为类似。微量元素的聚类分析见图3。从图3可以看出，组培与大棚种植金线莲明确归为一类，它们与野生金线莲的相似度较低。仿生态栽培时间越长，仿生态金线莲与野生金线莲的相似度越大。

3　结论与讨论

本研究结果表明，金线莲通过150 d以上的仿生态栽培，其药用品质可达到或接近野生金线莲水平。在金线莲仿生态栽培过程中，相对于微量元素的变化，指纹图谱的变化规律更为复杂，这可能与植物体中有机组分受多种因素的调控有关。因此仿生态金线莲的质量监控应结合多种指标进行综合评定，才能全面反映仿生态金线莲的品质特征。金线莲属于多年生兰科植物，每年10月期间开花，开花后药用价值降低，因此为了实现其药用品质和经济效益的最大化，建议每年3月种植访生态金线莲，9月采收金线莲。

不同栽培方式间金线莲的指纹图谱和微量元素差异明显，说明栽培环境对金线莲药用品质的影响较大，通过结合多种方式进行产品溯源是可行的。本研究中，虽然多个色谱峰被选定为仿生态金线莲品质评判参考，但其出峰时间与烟酸、芦丁和槲皮素的标准样品不一致，未能判断化合物具体种类。未来应就此做进一步分析鉴定，明确这些化合物在野生或仿生态金线莲中的含量范围。本研究表明野生或仿生态金线莲中存在大量的Fe元素，明显区别于其它种植方式，可作为本地野生或仿生态金线莲一个特征的评判指标，但评判标准尚需做大量的研究工作。本研究仅对金线莲中6种微量元素进行测定，今后需对更多的微量元素特征进行研究，以期发现更多可用于鉴定不同条件生长的金线莲的明显特征，为鉴定商品金线莲的品质提供有效的技术支撑。

参考文献：

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[2]谭嘉娜，陈月桂，罗剑飘，等.不同来源金线莲生长与品质对比分析[J].热带农业科学，2016，36(6)：62-65.

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