体外循环期间Th1、Tc1/Th2Tc2细胞亚群与机体致炎/抗炎反应的关系

倪海峰，肖颖彬

免疫功能失调是导致体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）创伤及术后并发症的原因之一，对其致病机制、临床救治的研究是心外科领域的重要课题。T细胞是机体重要的免疫调节效应细胞，CPB对Th1、Tc1/Th2、Tc2细胞功能亚群分化状态的影响目前研究尚少。笔者对临床CPB病例T细胞Th1、Tc1/Th2、Tc2细胞功能亚群变化及与机体致炎/抗炎反应变化关系进行观察，报告如下。

1　资料与方法

1.1研究对象 2015年3月—2016年12月，选取二尖瓣瓣膜病患者20例作为试验组，年龄31～55岁，男10例，女10例；动脉导管未闭患者20例作为对照组，年龄20～39岁，男10例，女10例。纳入标准：（1）年龄＞18 岁；（2）诊断明确，欲行 CPB 下二尖瓣置换术或非CPB下动脉导管结扎术；（3）患者知情同意接受该研究。排除标准：（1）有高血压、冠心病、糖尿病病史，或患有梅毒、乙型肝炎、丙型肝炎者；（2）有活动性感染、风湿活动期、肝肾疾病、慢性阻塞性肺部疾病者；（3）非首次心脏手术患者；（4）术前左心室射血分数＜40%；24 h内发生心绞痛、心肌酶谱升高者；1个月内发生心肌梗死患者；（5）术前1周内服用过影响免疫功能的药物者。

试验组于CPB下行二尖瓣置换术，转流时间62～91 min；对照组于非CPB下行动脉导管结扎术，手术时间65～98 min。于术前、CPB或手术开始20 min、停机前或手术结束时、术后4 h、术后24 h、术后72 h抽取静脉血。该研究经医院伦理委员会批准，受试对象及亲属签署知情同意书，研究过程符合伦理学原则。

1．2 方法 浓度梯度法分离单个核细胞，尼龙柱滤除B细胞，获取T细胞。提取T细胞RNA，－70℃保存。RNA印迹法检测T细胞IFN－γ/IL－4mRNA表达。细胞内因子染色、免疫荧光标记检测T细胞IFN－γ、IL－4蛋白表达。放射免疫试剂盒检测血清中IL－6、IL－10 浓度变化。

1.3数据处理 GDS8000图像分析量化，SPSS16．0软件数据处理，计量资料以均数±标准差 （x±s）表示。符合正态分布，采用配对t检验比较组内差异；不符合正态分布，采用非参数分析；重复测量采用方差分析比较组间差异。p＜0．05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1T细胞IFN-γmRNA蛋白表达变化 与术前相比，试验组CPB停机前IFN－γmRNA蛋白表达水平明显下调，差异有统计学意义（p＜0．05）；术后 4 h回升，至术后 24 h 基本恢复到术前水平（P＞0．05）。对照组各时相点IFN－γmRNA蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0．05）。 见图1～4。

图1　RNA印迹法检测T细胞内IFN-γmRNA表达变化

图2　T细胞内IFN-γmRNA表达变化

图3　表达IFN-γ蛋白的T细胞数量变化（激光共聚焦显微镜，400×）

图4　T细胞内IFN-γ蛋白表达变化

2.2T细胞IL-4 mRNA蛋白表达变化 与术前相比，试验组CPB停机前IL－4 mRNA蛋白表达水平明显上调，差异有统计学意义（p＜0．05）；术后 4 h下降，至术后 24 h 基本恢复到术前水平（P＞0．05）。对照组各时相点IL－4 mRNA蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0．05）。 见图5～8。

2.3IL-6水平变化 与术前相比，对照组手术开始20 min后，IL－6水平明显升高，差异有统计学意义（p＜0．01）；手术结束后 4 h 达到高峰，差异有统计学意义（p＜0．01）；术后 72 h 基本恢复术前水平（P＞0．05）。试验组虽同样出现 IL－6一过性上调，峰值位于术后4 h，但升高幅度明显低于对照组，差异有统计学意义（p＜0．05）；术后 72 h 基本恢复到术前水平（P＞0．05）。 见图9。

2.4IL-10水平变化 与术前相比，试验组CPB开始20 min后，IL-10水平明显升高，差异有统计学意义（p＜0.05）；停机前达到高峰，差异有统计学意义 （p＜0.01）； 术后24 h基本恢复到术前水平 （P＞0.05）。对照组各时相点IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图10。

图5　RNA印迹法检测T细胞内IL-4mRNA表达变化

图6　T细胞内IL-4mRNA表达变化

图7　表达IL-4蛋白的T细胞数量变化（激光共聚焦显微镜，400×）

图8　T细胞内IL-4蛋白表达变化

图9　外周血IL-6表达水平变化

图10　外周血IL-10表达水平变化

3　讨论

CPB创伤及并发症是重症心血管外科手术患者面临的危险因素之一，其致病机制、预防干预与救治研究是心外科领域的重要课题。1999年德国一项对6万例CPB手术病例的统计分析显示：CPB术后各种感染性、非感染性并发症是导致危重患者术后死亡的重要原因之一［1］。

以往研究表明，CPB可引起机体免疫功能发生改变，推测CPB创伤及并发症与机体免疫功能失调有关。T细胞作为机体重要的免疫调节、效应细胞，可能参与其发生与演变过程，但对CPB中T细胞分类及功能的变化情况，目前研究尚少。

研究认为，辅助 T细胞（Th）由 Th1、Th2两个细胞亚群组成，具有双向免疫调节作用，Th1/Th2失衡与多种疾病发生有关系［2-6］。临床研究也观察到CPB过程中，由Thl细胞分泌的致炎因子IFN-γ以及Th2细胞分泌抗炎因子IL-10水平发生了显著变化［7，8］。

进一步研究发现：细胞毒性T细胞（Tc）也可根据分泌的细胞因子谱，分为 Tc1和Tc2两种细胞亚群。Tc1/Tc2细胞亚群具有类似于Th1/Th2细胞亚群的生物学特征：诱导因素、产生的细胞因子种类、参与的免疫应答类型、分化调节机制等［9，10］。 研究表明：在CD4＋与CD8＋T细胞中，均存在能发挥同样双向调节与免疫效应的功能亚群。Tc1与Th1淋巴细胞、Tc2与Th2淋巴细胞，虽然细胞表面标志不同，但从功能和生物学效应上却可以分别归为同一个功能亚群。而随着对T细胞表面标志与生物学效应分子机制的逐步深入研究，以往以细胞表面标志或“效应性T细胞/调节性T细胞”“辅助性T细胞/抑制性T细胞”等传统方法进行的分类，已因为不能准确反映真实情况而受到挑战；而根据调节效应、生物学效应进行功能亚群分类，则是描述T细胞功能分类的新方法。

因此，笔者采用免疫印迹杂交、细胞内因子染色、免疫荧光、激光共聚焦显微镜等分子生物学试验方法，观察CPB对T细胞内IFN-γ/IL-4mRNA蛋白表达水平影响，了解CPB对Th1、Tc1/Th2、Tc2功能亚群影响。结果显示：CPB过程中，T细胞内由Th2、Tc2细胞亚群分泌的标志性抗炎介质IL-4 mRNA蛋白表达升高，由Th1、Tc1细胞亚群分泌的标志性致炎介质IFN-γmRNA蛋白表达下调，对照组未观察到类似变化。这种变化说明CPB中T细胞功能亚群发生变化：分泌致炎因子、诱导细胞免疫的Th1、Tc1细胞减少；分泌抗炎因子、诱导体液免疫的Th2、Tc2细胞增加；T细胞功能亚群分化向Th2、Tc2方向偏移。

笔者从免疫调节角度出发，观察Th1、Tc1/Th2、Tc2细胞亚群变化同时，对致炎因子IL-6、抗炎因子IL-10变化进行对照研究。结果表明：对照组IL-6上调，IL-10与 Th1、Tc1/Th2、Tc2细胞亚群无明显变化；试验组有不同表现：（1）IL-6虽较术前仍有升高，但明显低于对照组表达水平；（2）IL-10明显上调；（3）T细胞功能亚群分化向Th2、Tc2方向偏移。分析观察结果：对照组致炎因子IL-6表达上调，是机体非特异性免疫系统（中性粒细胞、补体等）的一种非特异性应激反应，导致炎性细胞活化、炎性介质表达上调，对抗手术创伤；特异性免疫系统Th1、Tc1/Th2、Tc2细胞亚群未产生变化，抗炎因子IL-10未随之改变。试验组中，CPB中低温、非生理性灌注等因素导致机体内环境变化，机体免疫系统、免疫细胞与CPB管道等各种变应原充分接触，诱导特异性免疫系统Th1、Tc1/Th2、Tc2细胞亚群产生变化，向Th2、Tc2方向偏移，抗炎因子IL-10上调，介导机体抗炎反应上调。虽然手术创伤也活化非特异性免疫系统，导致炎性介质IL-6上升，但由于主导致炎反应的Th1、Tc1细胞减少以及介导抗炎反应的IL-10的抑制效应，表达水平明显低于对照组。

其他研究结果显示：CPB致细胞免疫功能下降、IL-10 等抗炎因子水平升高［8，11］，结合对炎症介质观察结果［12，13］可看出，CPB 对机体非特异性、特异性免疫系统均有影响。这种变化是机体对CPB的一种防御性反应，有助于机体平安渡过手术期。在一些因素作用下，如果对Th1、Tc1/Th2、Tc2细胞亚群的影响超出防御反应范围，则可能演变成为致病因素：Th2、Tc2细胞介导的免疫应答过度，会引起细胞免疫功能抑制，削弱机体防御能力，易继发病原微生物感染，甚至引发败血症、多脏器功能不全、多脏器功能衰竭等一些严重并发症；Th1、Tcl细胞介导的免疫应答过度，可能引发全身非特异性炎性反应（SIRS），导致各种非感染性并发症，亦可损害器官功能，导致严重并发症。可以推测，Th1、Tc1/Th2、Tc2淋巴细胞功能亚群的失衡可能与CPB术后并发症的发生有关。

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