代谢组学在肾毒性药物评价中的应用

夏天一　张　凤　综述　陈万生　审校

代谢组学(metabolomics/metabonomics)是20世纪90年代兴起的组学技术的重要分支，也是系统生物学(system biology)研究的组成部分[1]。代谢组学技术关注于生物体在多种内外因素的作用下(遗传变异、药物作用、疾病影响、环境改变等)，内源性小分子代谢物(分子量小于1 000)所表征的机体物质、信息、能量代谢状况改变[2]。由于上述变化位于生物信息流的末端，因而能够放大上游基因组(genome)、转录组(transcriptome)和蛋白组(proteome)的变化，并通过生物体的表型(phenotype)直观表现出来。将小分子代谢物含量变化和病理、生理状况联系起来，通过组群分析的方式加以阐明，即可对疾病的发生、发展和转归进行解释[3]。代谢组学凭借其高通量、高灵敏度等特点，在药物研究领域表现出广阔的应用前景。Clayton等[4]于2006年提出了药物代谢组学(pharmacometabolomics)的概念，即通过代谢组学的技术平台，分析不同基因型和表现型个体在用药前后的代谢表型和药物反应表型的相关性，进而对药效和药物毒性产生更加深入的了解。该技术能够对药物的作用机制、作用范围、作用靶点等进行表征，在药物早期研发到临床应用的过程中具有得天独厚的优势[5]。

药物的毒理学研究是药物代谢组学研究的重要领域，也是最早应用的领域之一[6]。效、毒二重性几乎是所有药物的共性。一般而言，新药的研发过程需要长达6～15年的时间，需要大量的人力、物力和财力投入，而仅有约0.01%～0.02%的药物能够通过长期安全性试验和临床试验；药物的毒性不良反应也是药物召回、下市的主要原因，是威胁人类健康的潜在杀手[7-8]。早期对药物进行毒性评价，可以降低损害风险、减少经济损失，使得资源得到更为有效的利用。肾脏是药物毒性作用的重要靶器官。病因学研究认为，毒性药物及其代谢产物破坏肾小球、肾小管的正常结构和功能，改变细胞内外内源性物质的稳态，使代谢物水平发生紊乱，进而通过血液循环对靶组织或者靶器官产生影响，这种变化和药物的浓度、分布等因素紧密相关[9]，可以运用代谢组学的方法实现宏观把握与微观分析。经历了十几年的发展，代谢组学技术在实验操作、数据处理和结果诠释等方面形成了系统的分析方法，通过生物标志物鉴定、代谢途径检索、生物意义解析，能够辅助探明肾毒性药物的作用部位与作用机制。因此，本文旨在总结代谢组学技术在不同类型肾毒性药物中的研究现状，及其在肾毒性状态下的关键代谢通路改变，以期为药物肾毒性的早期预警(生物标志物的探索)、药物治疗方案优化和预后监测提供参考。

代谢组学应用于药物肾毒性评价的优势

药物肾毒性监控是医药工作者长期关注的临床问题，现有诊断往往通过病理学切片、生化指标检测对肾脏损伤情况进行评估。然而，病理切片具有高度的异质性，作为一种损伤性的检测手段，不适用于药物肾毒性的早期监测。同时，传统肾脏功能评价指标，如血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)等缺乏灵敏性。有研究表明，仅在肾功能下降50%时，SCr和BUN方产生可观测变化；上述理化指标易受到年龄、饮食、疾病等肾外因素的影响。

代谢组学研究因其系统性强、灵敏度高等特点相比于现有诊断方式展现出独特优势。作为药物肾毒性的有力评价手段，代谢组学具备如下特征：(1)实验样本“分析前”操作可靠。实验样本多为外周性生物样本(如血液、尿液等)，组织侵袭性较小，对同一动物或者人体可以进行连续多次采集，用于把握药物毒性的发生、发展、转归规律；样本的采集、保存、前处理等操作规范化，能够在保证样本真实性的基础上实现最大程度的有效生物信息提取[10]。(2)分析技术完善。近年来分析测试手段的完善为代谢组学准确定性/定量研究提供了有力的保证。常用质谱(MS)、核磁共振(NMR)等分析技术发展日趋成熟，可在简单样本“分析前操作”之后(气相质谱需要进行衍生化)，对样本中多种小分子化合物进行快速、有效鉴别，对化学结构、物质含量等信息进行解析[11]。(3)数据分析精准。从复杂的生物背景中提取重要的药物毒性相关信息是代谢组学数据分析重点。应运而生的生物信息学，集生物、数学、计算机、医学等多学科研究之大成，为代谢组学的数据分析提供了可靠的背景支持。运用逻辑回归(LR)、随机森林(RF)、支持向量机(SVM)、主成分分析(PCA)等机器学习方法，可以有效识别筛选药物毒性发展过程中的代谢形态变化[12]；代谢相关数据库(KEGG)可以辅助代谢产物的准确判断；生物背景定位可从基因、蛋白、酶等层次实现代谢谱变化的生物意义解析。

代谢组学在不同类型药物肾毒性评价的应用

氨基糖苷类药物氨基糖苷类抗生素水溶性好、性质稳定、抗菌谱广、杀菌能力强，被广泛应用于革兰阴性菌感染及严重的复杂细菌性的感染治疗。由于氨基糖苷类抗生素以原型排泄，通过细胞膜吞饮作用在肾皮质聚集，从而引发肾毒性反应。据文献报道，庆大霉素和妥布霉素的肾毒性几率高达14.0%和12.9%[13]。Sieber等[14]运用1H-NMR 和GC-MS的方法对庆大霉素肾病模型大鼠的血浆代谢谱进行分析，在考察不同用药剂量和用药时程后发现，肠道菌群相关代谢物变化明显。同时，某些通过肾小管重吸收的物质(如葡萄糖)含量有所下降，表明肾小管上皮细胞受到了实质性的损害。即庆大霉素可能通过改变肠道菌群使得机体内环境紊乱，并可直接在作用于肾小管上皮细胞造成肾损伤。

化疗药物顺铂是无机重金属抗肿瘤药，在体内主要通过原型或DNA结合的形式排出。由于顺铂在肾脏中能够长时间分布和高浓度蓄积，产生肾细胞毒效应，改变离子蛋白酶活性，造成肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤、自由基增多及相关凋亡等病理变化。Li等人通过快速液相色谱-飞行时间质谱(RRLC-QTOF/MS)的方法对顺铂诱导的SD大鼠肾损伤模型的血浆进行代谢组学分析，发现花生四烯酸、色氨酸等物质的含量变化。上述研究指出，顺铂可导致肾脏的微炎症状态，并诱发免疫调节紊乱[15]。

钙调磷酸酶抑制剂钙调磷酸酶抑制剂主要包括环孢素(CsA)和他克莫司(Tac)，是肝脏、心脏、肾脏等实体器官移植后用于免疫抑制治疗的基础用药，临床效果良好，应用广泛。目前在肾移植术后，主要采用CsA或Tac与吗替麦考酚酯(MMF)和泼尼松(Pred)三联用药的治疗方案。而钙调磷酸酶肾毒性是上述免疫治疗方案的重点关注点。Lenz等[16]建立了CsA诱导的SD大鼠肾毒性模型，通过NMR测定尿中代谢产物含量，发现三甲胺等物质含量有所上升，而三甲胺-N-氧化物的含量有所下降；通过HPLC-TOF/MS的数据分析得知，尿中黄尿酸、柠檬酸的含量下降，推断上述化合物的变化可能与肾近曲小管损伤有关。

其他药物除化学药物肾毒性之外，代谢组学技术在中药肾毒性研究中发挥了积极的作用。代谢组学统筹兼顾的特征与中药“整合”的思想不谋而合，无论是中药单体化合物、中药提取物，还是配伍复方，其潜在肾毒性机制均能够通过代谢组学的技术手段进行表征，并取得了初步的进展[17]。此外，代谢组学也为重金属元素肾毒性的早期发掘提供了技术支持[18]。

药物肾毒性关键代谢通路

氨基酸及生物胺类化合物肾脏在维持机体氨基酸池稳态中发挥重要作用。肾脏参与氨基酸的合成、降解、滤过、重吸收和分泌等诸多生理过程。从定量角度来看，肾脏承担50～70 g/d的氨基酸滤过，并有97%～98%被重吸收，从而实现血液循环氨基酸池与肌肉氨基酸池的中转平衡[19]。肾脏损伤可导致多种氨基酸含量/比值发生改变。(1)苯丙氨酸-酪氨酸通路[20]：肾损伤导致由肾脏释放的酪氨酸含量显著下降；同时，苯丙氨酸水解成酪氨酸效率降低，因此，可观测到酪氨酸/苯丙氨酸比值下降。(2)支链氨基酸代谢通路[21]：支链氨基酸(包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)参与机体的物质能量转化过程。蛋白能量营养不良(PEM)是肾损伤常见并发症，并继发代谢性酸中毒。在该疾病状态下，机体蛋白代谢呈现负氮平衡的状态，支链氨基酸代谢限速酶-支链氨基酸脱氢酶活化，支链氨基酸含量下降，进一步抑制蛋白合成，促进分解代谢。(3)精氨酸代谢通路[22]：体内10%～12% 的精氨酸由肾脏产生。精氨酸参与人体诸多生物学过程(一氧化氮、肌酐、胍丁胺、多胺合成，同时也是尿素循环的重要中间体)。多种研究表明，在肾损伤状态下，精氨酸蛋白质代谢产物对称二甲基精氨酸(SDMA)和非对称二甲基精氨酸(ADMA)含量显著上升，抑制体内一氧化氮合成，可作为肾损伤的生物标志物。(4)含硫氨基酸代谢[23]：含硫氨基酸(甲硫氨酸、胱氨酸、半胱氨酸)在肾损伤状态下的含量变化规律和腺苷高半胱氨酸(SAH)密切相关。由于肾脏是血浆SAH的主要调控器官，因而肾脏状况能够影响体液中含硫氨基酸的代谢。此外，药物毒性往往造成细胞线粒体损伤，细胞氧化呼吸过程受阻，中心碳代谢(三羧酸循环、尿素代谢等)也受到阻碍[24]。

脂质代谢部分小分子脂质，如脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂等在肾脏的正常生命功能调节和疾病调控等方面发挥重要作用[25]。多项研究证实，脂质代谢在多种肾脏疾病中(如慢性肾脏病、肾小球肾炎、糖尿病肾病、移植肾病)中均有改变。在肾毒性药物的刺激下，肾脏会发生氧化应激、能量代谢、血液流变学等病理变化，和脂质的生物学效应相吻合。如20-羟二十烷四烯酸和环氧环氧-二十碳三烯酸被证实与多种肾损伤类型有关；神经酰胺是肾损伤的独立预测因子[26]。

代谢组学在药物肾毒性评价的前景

科研工作者通过建立分析平台、测试分析方法、追溯上游基因改变和代谢物响应的情况，实现了一系列药物肾毒性生物标志物的筛选。借助于代谢组学技术，能够辅助确定药物的毒性机制、毒性靶组织、毒性剂量范围，寻找特异性的毒性生物标志物。

然而，在药源性肾毒性的代谢组学研究中，尚且存在一些问题悬而未决：代谢产物、药物剂量与肾脏病理改变的量化关系尚未建立；多数研究纳入样本不具有广泛代表性，研究停留在动物模型水平；需要通过多中心大样本临床试验克服性别、年龄、种族等因素引入的系统误差；需要建立已知毒性代谢产物的数据库，以便在对未知药物探索时进行比较；需要将代谢产物变化和病因学、药物毒理学研究结合起来；需要对不同类型药物的毒性生物标志物、药物肾毒性与其他肾脏疾病加以区分。目前英国伦敦大学的皇家科学院和Pfizer制药公司等多个组织联合于2001年建立了一个用于药物毒性监测的专家系统，即国际代谢组毒理学委员会(Consortium for Metabonomic Toxicology，COMET)，已对150多种肝肾毒性的药物展开研究，而我国尚且缺乏类似系统的、集中化研究。

综上所述，在代谢组学研究的基础上，实现多组学整合，建立可靠的生物标志物体系，才能全面系统地分析毒性物质作用于肾脏后的基因表达改变、蛋白水平变化和组织水平的代谢产物变化，为药源性肾毒性研究中阐明药物的作用机制、实现药物的安全性评价提供技术手段和平台，为了解肾毒性的发生机制、指导临床用药提供参考。

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