非融合海参溶菌酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶活鉴定

张 　 齐，　牛 庆 昌，　姜 　 琳，　黄 　 君，　马 　 俊，　丛 丽 娜，　李 　 成

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )

0　引　言

溶菌酶作为海参先天免疫系统中的重要组成成分，是机体应对病原菌的重要免疫应答因子[1]。作为新型的i型海洋动物溶菌酶，它是天然的抗菌剂、免疫增强剂和防腐剂，近年来已经成为研究的热点。研究表明，作为典型的i型溶菌酶代表，海参溶菌酶属于多功能蛋白，它不仅具有溶菌酶活性，还有异构肽酶活性[2-4]。研究海参溶菌酶的生物学活性，能更好地分析其性质、作用和功能，以便对其进行深入的研究和应用。

国内外已有在原核细胞和真核细胞中表达海参溶菌酶的报道，但在真核细胞中的表达仍然存在产量低、培养细胞成本高、制备纯化工艺复杂等问题。而原核细胞中仅可见海参溶菌酶融合蛋白的表达，但是人为添加肽段也产生一些问题。融合标签蛋白Trx-His-S tag肽段的添加包埋了海参溶菌酶的酶活位点，抑制了蛋白的抑菌活性[5]。因为在很多研究中，真正需要的是没有附加片段的目的蛋白质，而额外添加的肽段(即使是很短的)会影响产物蛋白质的功能，干扰实验结果，而且融合蛋白的多余肽段对重组蛋白的活性和安全性有潜在的影响。因此，能否有效而完整地把各种融合肽段切除并再生出非融合的海参溶菌酶目的蛋白就成为后续相关研究和应用的关键。

本实验利用大肠杆菌表达系统获得了重组海参溶菌酶rSjLys，利用肠激酶将其融合标签成功切除。成功获得无融合标签、具有抑菌活性的海参溶菌酶SjLys，以期为海参溶菌酶的深入研究开发和利用提供良好的理论依据。

1　材料和方法

1.1　材　料

基因工程菌RoSetta(DE3) plysS，实验室保存；表达载体pET32a(+)-SjLys，本实验室构建。Ni2+-NTA亲和层析填料、重组牛肠激酶(rEK)、牛血清白蛋白，金斯瑞生物科技有限公司(南京)；蛋白Marker，大连宝生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2　方　法

1.2.1rSjLys的表达

通过热激法将实验室构建好的表达载体pET32a(+)-SjLys，转化大肠杆菌宿主RoSetta(DE3) plysS。Amp+抗性筛选阳性重组子RoSetta(DE3) plysS-pET32a(+)-SjLys。

将基因工程菌过夜活化获得种子液，再按照1%的接种量转接到500 mL LB发酵培养基中，在37 ℃、160 r/min条件下发酵至OD600 nm0.7左右时，加入诱导剂IPTG，使终浓度为0.5 mmol/L，诱导重组海参溶菌酶蛋白的表达。在28 ℃、120 r/min 下培养15 h[6]，低温离心收集菌体。将菌体用PBS清洗两次后于-80 ℃冻存。

1.2.2rSjLys的分离纯化及鉴定

菌体细胞经过冻融处理后超声破碎。将样品在低温条件下离心收集上清液。将上清液过滤后，上样Ni2+-NTA亲和层析柱。以30 mmol/L咪唑冲洗未结合的杂蛋白，通过不同浓度的咪唑对目的蛋白进行洗脱。12% SDS-PAGE检测蛋白的纯化情况及其纯度。

1.2.3rSjLys的三级结构预测

使用表达载体pET32a(+)表达外源海参溶菌酶时，会在目的蛋白的N端附加上较大的融合标签蛋白Trx-His-S tag，分子质量17.9 ku，形成重组融合海参溶菌酶蛋白。利用Swiss model(https://swissmodel.expasy.org/)的同源建模对重组海参溶菌酶的三级结构进行预测。在First approach mode中输入目的蛋白的全长氨基酸序列，在线进行同源序列比对后建模。利用能量最小化原理，预测了重组海参溶菌酶rSjLys的三级结构。

1.2.4rSjLys的肠激酶酶切

为获得SjLys，需人工去除融合标签蛋白Trx-His-S tag，从而释放SjLys目的蛋白。实验采用重组牛肠激酶，其N端带有6个组氨酸标签，特异性酶切Trx-His-S tag和海参溶菌酶之间的酶切位点DDDK[7-9]。

经实验发现，5 U的重组牛肠激酶在温度22 ℃ 的条件下酶切16 h能够完全裂解15 μg的蛋白，建立的肠激酶酶切反应体系能够完全地将标签蛋白Trx-His-S tag和SjLys分开。实验体系：10×重组牛肠激酶反应缓冲液5 μL，0.3 mg/mL融合蛋白40 μL，5 U/μL重组牛肠激酶2.5 μL，再补充4.5 μL ddH2O至总体积50 μL。反应条件：22 ℃，16 h[10]。酶切结束后，用15%的SDS-PAGE电泳检测酶切效果。

1.2.5SjLys的纯化

将酶切后的溶液上样Ni2+-NTA亲和层析柱，直接收取上样流出液；再用漂洗缓冲液冲洗，收集流出液；最后用含有400 mmol/L 咪唑的洗脱液洗脱Ni2+-NTA并收集流出液中的标签蛋白。纯化结束后，用15% SDS-PAGE电泳检测海参溶菌酶的纯化结果。

1.2.6SjLys抑菌活性的检测

以溶壁微球菌作为指示菌，采用牛津杯法分别检测重组融合海参溶菌酶及非融合海参溶菌酶的抑菌活性[11-13]。将100 μL溶壁微球菌接种在10 mL的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min、12 h 过夜培养。在LB固体培养基上均匀涂布100 μL过夜培养的指示菌，放上已灭好菌的牛津杯，向杯中加入200 μL样品过夜培养，检测抑菌活性[14]。

2　结果与讨论

2.1　rSjLys的表达及纯化

重组质粒pET32a(+)-SjLys转化E.coli感受态RoSetta(DE3) plysS细胞，氨苄抗性筛选阳性重组子RoSetta(DE3) plysS/pET32a(+)-SjLys。通过IPTG诱导基因工程菌，表达重组融合海参溶菌酶蛋白rSjLys，SDS-PAGE检测结果如图1所示。与未加诱导剂IPTG的菌体上清液比较(lane 1)，加入诱导剂后，RoSetta(DE3)plysS/pET32a(+)-SjLys菌株在29.0 ku附近多出一条明显的高丰度蛋白条带(lane 2)。标签蛋白Trx-His-S tag的分子质量约为17.9 ku，SjLys的分子质量为14.3 ku，因此目的重组融合海参溶菌酶的实际分子质量应为29.2 ku。说明成功表达了目的蛋白rSjLys。

M， marker；1，诱导前；2，诱导后；3～5，分别为100、200、300 mmol/L咪唑纯化后的蛋白

对rSjLys进行分离、纯化。从图1可以看出，100和200 mmol/L的咪唑就能将部分目的蛋白洗脱，但是具有明显的杂蛋白(lane 3，lane 4)。而300 mmol/L的咪唑洗脱下来的目的蛋白经过BandScan5.0分析表明，目的蛋白rSjLys的纯度大于99%。实验结果表明，工程菌RoSetta(DE3) plysS/pET32a(+)-SjLys经IPTG诱导后，在菌体上清液中成功表达了融溶状态的rSjLys。经过咪唑梯度洗脱后，成功获得了高纯度的重组融合海参溶菌酶蛋白。

2.2　rSjLys三级结构的模拟

基因工程菌经表达载体pET32a(+)表达的外源蛋白会在目的蛋白的N端附加上较大的融合Trx-His-S tag标签蛋白。本实验通过Swiss model蛋白结构预测分析在线软件，对rSjLys的三级结构进行预测。结果如图2所示，海参溶菌酶会形成以α螺旋为主要二级结构的高度折叠态(红色和绿色区域)，标签蛋白的氨基酸序列能在海参溶菌酶蛋白的N末端折叠成独立的、完整的结构域。

图2　rSjLys的三级结构模拟图

研究表明，海参溶菌酶溶解细菌，通过蛋白的N端结构域水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁中不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出从而杀死细菌。对融合海参溶菌酶蛋白的结构预测发现，融合标签Trx-His-S tag所形成的结构域主要集中在海参溶菌酶的侧端(图2)。因此，融合标签会在很大程度上影响目的蛋白的抑菌活性。另外，额外添加的融合蛋对开发利用rSjLys的安全性也会有潜在的影响。

2.3　SjLys的制备与纯化

融合标签Trx能在蛋白质的形成过程中帮助蛋白质进行正确折叠，有助于提高蛋白质复性效率，并具有提高基因表达产量等优点。表达成功后，利用工具酶从融合蛋白释放目的蛋白。目前去除融合标签的策略主要有化学裂解法[15]和酶裂解法[16]两种，酶裂解法因特异性较高、反应条件较温和，成为目前较为常用的裂解方法。肠激酶是最常用的裂解酶，它对融合蛋白N端的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点有很高的特异性，并在识别位点的C端进行切割，从而保证获得不带任何附加氨基酸、与天然多肽氨基酸序列完全一致的目的蛋白。

将实验纯化所得的rSjlys，用N端带有6个组氨酸标签的重组牛肠激酶进行酶解，以切除标签蛋白Trx-His-S tag序列，释放目的蛋白SjLys。实验结果如图3所示，纯化获得的重组蛋白rSjlys(lane 2)，被rEK彻底酶解成两部分肽段，Trx-His-S Tag和Sjlys (lane 1)。表明实验通过肠激酶，有效、完整地切开了rSjLys的融合肽段Trx-His-S tag，释放了目的蛋白。

M， marker；1， rEK酶切后；2， rEK酶切前

采用的rEK为重组蛋白，其N末端带有6个组氨酸标签，rSjLys重组融合标签Trx-His-S tag也带有6个组氨酸标签。由实验可结果知，酶切下来的海参溶菌酶不带有任何标签序列。所以酶解完全的样品可以利用Ni2+-NTA亲和层析柱进行分离、纯化。将酶切完全的样品用镍离子亲和色谱柱纯化。其中，rEK和融合标签由于含有组氨酸标签，可以特异性结合镍柱上的Ni2+离子；而海参溶菌酶由于缺少这样的亲和位点，酶解液上样后将直接穿过柱子。

利用15%的SDS-PAGE对纯化回收后的产物进行检测，结果如图4所示，样品中目的蛋白SjLys直接穿柱流出(lane 3)，其分子质量约为14 ku，与实际SjLys分子质量大小相符。经BandScan 5.0分析表明，目的蛋白SjLys的纯度大于99%。标签蛋白几乎全部结合在亲和柱上(lane 4)。

结果表明，本实验通过rEK酶切、分离、纯化成功获得了非融合海参溶菌酶SjLys蛋白。

2.4　SjLys的酶活性检测

以溶壁微球菌为指示菌，牛津杯法检测蛋白的抑菌活性，如图5所示。通过与阴性空载对照、rSjLys比较，结果表明SjLys对溶壁微球菌具有明显的抑制作用。表明带有标签序列的rSjLys在原核宿主Rosetta宿主内以融溶状态表达，但是，融合标签确实对蛋白的抑菌活性区域具有屏蔽作用(图2)。根据模拟的SjLys的三级结构，由于SjLys蛋白的抑菌活性位点主要集中在N末端，标签序列对SjLys的活性有影响，所以原核表达出的rSjLys抑菌活性明显缺失，切掉标签后的非融合蛋白SjLys对指示菌溶壁微球菌表现出明显的抑菌效果。同时，也在一定程度上证明了，即使有标签蛋白的屏蔽作用，目的蛋白SjLys的高级结构在原核宿主内可以正确折叠。

M， marker；1，酶切前；2，酶切后；3，上样流出液；4， 400 mmol/L咪唑纯化后的蛋白

图4rSjLys肠激酶酶切产物SjLys的纯化回收

Fig.4Enterokinase digestion of rSjLys and purification and recovery of SjLys

(a) 阴性对照

(b) rSjLys

(c) SjLys

图5SjLys抑菌活性的检测

Fig.5Antimicrobial activity of SjLys

3　结　论

实验利用Ni2+-NTA纯化获得了高纯度的重组海参溶菌酶。进一步利用重组牛肠激酶对重组蛋白的标签进行酶切，再通过亲和层析进行纯化，制备出非融合海参溶菌酶SjLys。抑菌结果表明，体外纯化的非融合海参溶菌酶蛋白对溶壁微球菌具有明显的抑菌活性。本实验通过一系列的酶切、纯化等步骤，体外成功获得了具有抑菌活性的非融合海参溶菌酶蛋白。

参考文献:

[1] BECK G, HABICHT G S. Immunity and the invertebrates[J]. Scientific American, 1996, 275(5): 60-66.

[2] JOSKOVA R, SILEROVA M, PROCHAZKOVA P, et al. Identification and cloning of an invertebrate-type lysozyme fromEiseniaandrei[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2009, 33(8): 932-938.

[3] ZAVALOVA L L, BASKOVA I P, LUKYANOV S A, et al. Destabilase from the medicinal leech is a representative of a novel family of lysozymes[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1478(1): 69-77.

[4] TAKESHITA K, HASHIMOTO Y, UEDA T, et al. A small chimerically bifunctional monomeric protein:Tapesjaponicalysozyme[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2003, 60(9): 1944-1951.

[5] 武瑶,梁雯婧,李成,等.热处理对海参溶菌酶C端多肽的抑菌活性和结构的影响[J].高等学校化学学报,2014,35(5):1044-1050.

[6] 常艺海,丛丽娜,卢冬,等.重组海参溶酶基因工程菌的构建及原核表达[J].大连工业大学学报,2012,31(6):391-394.

[7] 赵阳,黄鹤.利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备rhIL-11[J].中国实验血液学杂志,2008,16(4):903-909.

[8] 修朝阳,周贺钺,俞璎,等.利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备重组人甲状旁腺素(1～34)肽[J].生物化学与生物物理学报,2002,34(4):469-474.

[9] 易进华,王罗春,张元兴.重组肠激酶酶切Trx-rPA融合蛋白的研究[J].中国医药工业杂志,2007,38(6):419-422.

[10] 卢雪梅,黄演婷,金小宝,等.重组融合蛋白Trx-IFN-CSP的肠激酶酶切及纯化[J].生物技术,2015,25(5):491-494.

[11] 姜启晨,丛丽娜,宋明徽,等.海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母中的重组表达[J].大连工业大学学报,2013,32(6):395-398.

[12] 王秀霞,丛丽娜,王丹,等.海刺参i-型溶菌酶基因的重组表达及抑菌谱分析[J].生物工程学报,2009,25(2):189-194.

[13] CONG L N, YANG X J, WANG X X, et al. Characterization of an i-type lysozyme gene from the sea cucumberStichopusjaponicus, and enzymatic and non-enzymatic antimicrobial activities of its recombinant protein[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(6): 583-588.

[14] 刘兴敏,何自福,李华平,等.溶菌酶基因合成及其原核表达[J].华南农业大学学报,2007,28(1):55-57.

[15] BOUMAIZA M, JAOUEN M, DESCHEMIN J C, et al. Expression and purification of a new recombinant camel hepcidin able to promote the degradation of the iron exporter ferroportin1[J]. Protein Expression and Purification, 2015, 115: 11-18.

[16] RYAN R O, FORT T M, ODA M N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I[J]. Protein Expression and Purification, 2003, 27(1): 98-103.