盐芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

杨少辉，李 爽，寇莹莹，王洁华，宋英今，关春峰



盐芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

杨少辉，李 爽，寇莹莹，王洁华，宋英今，关春峰

(天津大学环境科学与工程学院，天津 300350)

磷(P)是植物生长发育过程中重要的矿质营养元素之一，PHT1磷酸转运蛋白家族负责调控植物从土壤中吸收磷以及细胞间无机磷(Pi)的转运．本文以盐芥幼苗根cDNA为材料，克隆到盐芥磷酸转运蛋白ThPHT1;8基因．生物信息学分析结果表明，ThPHT1;8蛋白编码525个氨基酸残基，蛋白分子质量为58.1,ku，等电点6.33，是一个定位在细胞膜上的疏水、无信号肽的非分泌性蛋白，含有高亲和力磷酸转运蛋白典型的跨膜结构．实时定量PCR结果显示，低磷胁迫能促进ThPHT1;8基因在盐芥根部的表达，而且不同磷浓度处理下ThPHT1;8基因表达的模式不同．ThPHT1;8基因在转基因拟南芥中的生物学功能研究表明，不同浓度低磷胁迫处理下，与野生型拟南芥相比，35S：ThPHT1;8转基因拟南芥幼苗的主根根长显著增加、侧根密度显著降低，叶绿素含量、无机磷和总磷含量提高，花青素含量降低．上述结果表明，盐芥ThPHT1;8基因确实参与低磷胁迫时植物的应答，能够提高转基因拟南芥的耐低磷能力，为土壤磷高效利用提供了一种有潜力的候选功能基因．

盐芥；磷酸转运蛋白；生物信息学；ThPHT1;8基因

磷是构成许多生命大分子物质(如核酸、磷脂，ATP等)的重要结构组分，是植物生长发育过程中不可缺少的矿物元素，在酶促反应、能量转移、物质代谢等多个过程中起着重要作用[1]．近年来，地球上的磷矿资源逐年减少，而且磷在土壤中的存在形式大多为难溶性磷和有机态磷[2]，可被植物吸收利用的有效磷浓度很低．农业生产中，磷肥的过度使用不仅造成土壤中难溶性磷的进一步积累，且土壤磷流入水体后导致水体富营养化，带来一系列生态环境问题[3].因此，挖掘促进磷高效吸收的基因资源，探讨植物高效吸收磷素的分子机制，提高低磷条件下植物吸收磷素的能力，具有重要的生态和经济价值．

磷酸转运蛋白是植物吸收磷的主要介质，植物通过磷酸转运蛋白将外界无机形式的磷转为能够被植物吸收和利用的有效磷．近年来，国内外学者开展了一系列关于磷酸转运蛋白基因的克隆和表达调控的研究，为了解植物体内磷的吸收和转运过程奠定了分子基础[4]．在生物体中，磷酸转运蛋白可被分为PHT和PHO两大类，PHO是PHT的突变体[5]．自1996年，Muchhal等首次以酵母的磷酸转运蛋白基因为探针，在拟南芥中克隆到两个磷酸转运蛋白基因以来，数十个编码磷酸转运蛋白的基因家族成员陆续从番茄、烟草、水稻等多种植物中克隆得到[6-9].根据环境等介质中磷浓度的不同，磷酸转运蛋白被分为低亲和力系统、高亲和力系统两大类，其中PHT1家族为高亲和力转运蛋白，PHT2家族为低亲和力转运蛋白．基因家族中的很多成员，如拟南芥、、、油菜和水稻等，在植物体内的表达模式及其对植物磷吸收的影响已被报道[10-13]．

盐芥()，双子叶纲、十字花科草本，拟南芥的近缘植物，具有株型小、生活周期短、基因组小、cDNA序列与拟南芥相似程度高等优点．又由于其具有很强的耐盐、耐旱性，并且对冷害、低氮、低磷等逆境胁迫也有较高的耐受能力[14]，因此已逐渐成为研究非生物胁迫响应的模式植物．目前，对盐芥耐低磷的研究还很少，主要涉及低磷胁迫下植株的生理响应及耐低磷相关基因的表达模式[15-17]，而对盐芥磷转运蛋白基因家族的研究鲜见报道．本研究从盐芥中克隆了一个与拟南芥高亲和力磷酸转运蛋白基因同源性最高磷酸转运蛋白基因，命名为，利用生物信息学方法对ThPHT1；8蛋白的理化性质、疏水性及跨膜结构等方面进行了预测与分析，通过实时定量PCR和转基因拟南芥，进一步研究盐芥基因在低磷胁迫下的表达模式及对转基因植物磷吸收能力的调控作用．

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌()DH5α、根瘤农杆菌()C58、载体pBI121由本实验室保存．CloneJET PCR Cloning Kit购自Thermo公司，ClonExpress® II One Step Cloning Kit购自Vazyme公司，其他分子生物学试剂均购自Takara公司，组织无机磷和总磷含量测定试剂盒购自索莱宝公司，引物合成及DNA测序均由华大生物公司完成．

盐芥和拟南芥()Col-0由本实验室保存．培养条件为温度(22±2)℃，光周期为16,h光照/8,h黑暗，光强6,000,lx．

参照Feng等[13]的方法，以MS培养基为基本培养基，配制磷浓度为0,μmol/L、50,μmol/L和500,μmol/L的1/2MS培养基，培养基中减少的钾离子由K2SO4补充．

1.2 基因的克隆与过表达载体构建

在Phytozome v 11数据库(https：//phytozome. Jgi. Doe. gov/pz/portal．html)中获得基因的序列，利用Primer 5.0软件设计基因的克隆引物1,F/1,R．利用RNA试剂盒提取盐芥幼苗根的总RNA，Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳测定RNA浓度和质量．以Oligo(dT)为引物，使用反转录试剂盒合成cDNA，并以此为模板进行PCR扩增．20,μL反应体系包括：-1,F和-1,R各0.8,μL，2×Taq Master Mix 10,μL，H2O 6.4,μL，DNA 2,μL．反应程序：95,℃预变性5,min，95,℃变性30,s，58,℃退火30,s，72,℃延伸2.5,min，变性-退火-延伸为1个循环，连续35个循环，然后在72,℃延伸10,min．

扩增产物纯化回收后，利用CloneJET PCR Cloning Kit获得克隆载体pJet1.2-Thpht1；8，测序正确后，利用ClonExpress® II One Step Cloning Kit，参照产品说明书，将基因片段与pBI121载体片段进行重组连接．连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，经抗生素筛选和菌落PCR验证，最终获得由35,S启动子驱动的植物过量表达载体pBI121-ThPHT1；8．

1.3 生物信息学分析

利用克隆得到的ThPHT1；8蛋白序列，在NCBI数据库中搜索与其相似度较高的磷酸转运蛋白序列，利用CLUSTAL X 2.1软件和MEGA 6.0软件进行多重比对并构建系统发育树，对得到的系统发育树进行2,000次抽样的自展法(Bootstrap)校正[18-19]．利用ProtParam程序(http//expasy.org/tools/protparam.html)分析ThPHT1；8蛋白的理化性质[20-21]，利用SignalP 4.1(http://www.Cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM v.2.0(http：//www.Cbs.Dtu.dk/services/TMHMM/)在线分析信号肽序列和跨膜区域[22-23]，利用WoLF PSORT (http://wolfpsort.seq.cbrc.jp)和PHYRE 2(http://www. sbg.bio.ic.ac.uk/phyre)服务器分别进行ThPHT1；8蛋白的亚细胞定位和3级结构预测[24]．

1.4 ThPHT1；8基因在不同磷浓度处理下的表达分析

盐芥种子消毒后置于4,℃冰箱中春化15,d，然后点在1/2,MS(磷浓度为625,μmol/L)固体培养基上，光照培养箱中垂直培养6,d．选取长势相同的幼苗，分别移到磷浓度为0,μmol/L、50,μmol/L、500,μmol/L的磷处理培养基上继续培养．分别在处理12,h、24,h、48,h、3,d和7,d时，提取盐芥根部RNA，反转录合成cDNA．

以作为内参基因，进行实时定量PCR分析．的定量引物2,F/2,R，的定量引物3,F/3,R．10,μL反应体系包括：上下游引物各0.3,μL，2×SYBR Green Real Master Mix 5,μL，H2O 2.4,μL，cDNA 2,μL．在PikoReal software软件中设置反应程序为：95,℃，3,min；45个循环(95,℃，20,s；58,℃，20,s；72,℃，30,s)；72,℃，30,s．

表1 引物序列

Tab.1 Primersequence

1.5 拟南芥的转化及阳性苗的鉴定

构建好的表达载体pBI121-ThPHT1；8通过电击法转化农杆菌C58感受态细胞，菌落PCR鉴定为阳性的农杆菌通过浸花法转化拟南芥．T1代转基因拟南芥的种子在含50,μmol/L卡那霉素的1/2,MS固体培养基上进行抗性筛选，提取抗性苗的基因组DNA，利用克隆引物1,F/1,R进行PCR鉴定．收获T1代PCR阳性苗的种子，经T2代繁殖及抗性筛选最终得到转基因的T3代纯合体．

1.6 过量表达ThPHT1;8对拟南芥的影响

转基因拟南芥和野生型对种子消毒后，4,℃春化3～4,d，平铺在1/2,MS(磷浓度为625,μmol/L)平板上，光照培养箱中垂直培养5,d．选取长势相同的幼苗，分别移到磷浓度为0,μmol/L、50,μmol/L、500,μmol/L的磷处理培养基和1/2,MS对照培养基上垂直培养．5,d后取不同处理的植物叶片，参照Carter等[25]的方法进行叶绿素含量的测定，花青素含量的测定方法参照胡可等[26]的方法，叶片总磷、无机磷和有机磷含量的测定参照试剂盒说明书操作．

2 结果与分析

2.1 盐芥磷酸转运蛋白基因的克隆

根据Phytozome v 11数据库的查询结果可知，盐芥基因的基因组DNA序列全长为2,544,bp，在686,bp后有1个966,bp的内含子序列，CDS序列全长1,578,bp．以盐芥幼苗根的cDNA为模板，-1,F和-1,R为引物，进行PCR扩增．琼脂糖凝胶电泳显示，获得清晰、单一、大小约为1,600,bp左右的条带(见图1(a))．PCR产物构建克隆载体pJet1.2-ThPHT1；8后，DNA测序结果显示，扩增产物长1,578,bp，编码525个氨基酸残基，与数据库中基因的CDS序列一致.经比对，该序列与拟南芥高亲和力磷酸转运蛋白基因同源性最高(80.78%,)．因此，确定克隆得到盐芥的磷酸转运蛋白基因，命名为.

图1 ThPHT1；8基因的克隆和pBI121-ThPHT1；8表达载体的鉴定

利用ClonExpress® II One Step Cloning Kit，将基因片段与pBI121载体片段进行重组，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，经抗生素筛选和菌落PCR验证(见图1(b))，最终获得植物表达载体pBI121-ThPHT1；8．

2.2 生物信息学分析

为了研究盐芥ThPHT1；8与其他物种磷酸转运蛋白的进化关系，对ThPHT1；8蛋白与相似度较高的序列进行了系统进化树的构建，由图2(a)可以看出，ThPHT1；8蛋白与油菜()、萝卜()和芜菁()的高亲和力磷酸转运蛋白PHT1；8亲缘关系最近；与拟南芥、天蓝遏蓝菜()和亚麻荠()的高亲和力磷酸转运蛋白PHT1；8同源性也较近．利用ProtParam程序对盐芥基因所编码的蛋白进行理化性质分析，结果表明，ThPHT1；8蛋白分子质量为58.1,ku，等电点为6.33；该蛋白质由525个氨基酸残基组成，其中正电荷氨基酸残基数45个，远大于负电荷氨基酸残基数，不稳定系数为39.78，总平均亲水指数GRAVY为0.348(GRAVY大于0表明蛋白为疏水蛋白)，表明ThPHT1；8蛋白是一种较稳定的疏水性蛋白质．

信号肽可以引导分泌性蛋白进入其他细胞并使功能，对蛋白质分泌过程非常重要．SignalP 4.1,Server分析的结果(见图2(b))表明，ThPHT1；8蛋白不具有信号肽序列，是非分泌蛋白．利用TMHMM Server v.2.0对ThPHT1；8蛋白进行跨膜区域预测分析，该基因编码525个氨基酸序列，共含有12个跨膜螺旋区(见图2(c))，在第6个和第7个跨膜区之间有一个亲水性电荷区，该预测结果与已报道的其他物种PHT1蛋白家族跨膜结构一致[27]，因此推断盐芥ThPHT1；8是高亲和力磷酸转运蛋白．通过在线软件WoLF PSORT进行亚细胞定位预测，发现ThPHT1；8蛋白质位于细胞质膜上．为了进一步了解ThPHT1；8蛋白的特征，利用PHYRE2服务器，以人类葡萄糖转运蛋白家族(glucose transport protein family)的c5c65A为模板预测了蛋白的3级结构(见图2(d))，结果表明基因所编码的525个氨基酸中有446氨基酸序列与模型的匹配性高达100%,，在第1～525位氨基酸建模，模型覆盖率85%,．盐芥ThPHT1；8蛋白与其他植物的磷转运蛋白PHT1家族成员具有极其相似的折叠和空间构形，这也暗示该蛋白与其他植物PHT1蛋白具有类似的活性和功能．

图2 ThPHT1；8蛋白的生物信息学分析

2.3 不同磷浓度处理下ThPHT1;8基因的表达分析

为了分析低磷胁迫下基因的表达模式，分别提取在不同磷浓度(0,μmol/L、50,μmol/L、500,μmol/L和对照组1/2,MS(625,mmol/L))培养基中处理不同时间(12,h、24,h、48,h、3,d、7,d)的盐芥幼苗根部的RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，利用实时定量PCR技术，分别以1/2,MS上处理不同时间的盐芥幼苗根部的RNA为对照，检测不同的磷浓度和胁迫时间下基因在盐芥根部的表达模式．

由图3可知，基因经不同浓度磷胁迫处理后，均能被诱导表达并达到峰值，之后随着时间的持续，表达量呈现下降再升高的趋势；不同浓度磷处理下，基因的最高表达量不同，达到峰值的诱导时间也不同．其中，0,μmol/L磷浓度处理中，处理12,h时相对表达量达到峰值，是对照的2.5倍，与对照差异显著；50,μmol/L和500,μmol/L磷浓度处理中，基因在磷处理12,h前表达水平降低，之后持续受到诱导，48,h时相对表达量达到峰值，分别达到对照的1.70倍和1.55倍．在低磷胁迫48,h之前，0,μmol/L处理下基因的相对表达量随处理时间的增加而降低，50,μmol/L和500,μmol/L处理中的相对表达量随低磷胁迫时间的增加不断升高，48,h时达到峰值；胁迫处理3,d时，3种磷浓度处理中基因的表达均降低，500,μmol/L磷浓度处理的表达量下降较大；胁迫处理7,d时，3种磷浓度处理中基因的表达升高，其中0,μmol/L磷浓度处理的表达量较高，与对照比较有差异．这表明基因确实参与盐芥低磷胁迫时的应答响应，受低磷诱导，而且对于不同磷浓度胁迫有不同的响应机制．

图3 不同磷浓度处理不同时间后盐芥根部ThPHT1;8基因的实时定量分析

2.4 过量表达ThPHT1;8对拟南芥根系的影响

由系统进化树和实时定量PCR结果可知，属于高亲和力磷酸转运蛋白基因家族的成员．为了进一步明确盐芥在植物体内的磷酸转运功能，构建过表达载体pBI121-ThPHT1；8，并通过浸花法转化拟南芥，经卡那霉素抗性筛选和基因组PCR鉴定，获得转基因的T3代转基因拟南芥纯合体．以1/2,MS培养基(625,μmol/L)为对照，分析不同磷浓度(0,μmol/L、50,μmol/L、500,μmol/L)处理5,d对转基因拟南芥根系的影响，如图4所示．

图4 不同磷浓度处理5,d后35S：ThPHT1;8转基因拟南芥根系结构分析

图4结果表明，在正常磷处理(1/2,MS，625,mmol/L)中，转基因拟南芥幼苗根系的生长情况与野生型基本相同．由图4(a)和(b)可以看出，在3种磷胁迫处理中，转基因拟南芥的主根长度均明显大于野生型(WT)，随着磷浓度的提高，野生型和转基因拟南芥植株的主根长度均逐渐增加．其中，0,μmol/L和50,μmol/L磷处理时，转基因拟南芥的平均主根长度分别比野生型长7%,和10%,，差异显著；500,μmol/L磷处理时，转基因拟南芥比野生型的平均主根长高22%，差异极显著(见图4(b))．由图4(c)可以看出，在3种磷胁迫处理中，转基因拟南芥的侧根密度均小于野生型的侧根密度，而且随着磷浓度的降低，不仅转基因拟南芥和野生型的侧根密度逐渐增加，而且两者的差异越来越大．正常磷处理(对照组1/2,MS)时，转基因拟南芥和野生型幼苗的侧根密度无显著差异；而0,μmol/L处理时，野生型的侧根密度比转基因拟南芥的侧根密度高12.7%，差异极显著．上述结果表明，为了适应低磷胁迫下磷的有效利用，转基因植株根系的生长和形态建成都发生了变化．

2.5 过量表达ThPHT1;8对拟南芥生理指标的影响

逆境胁迫下植物体内叶绿素含量发生变化．分析转基因拟南芥与野生型植株在不同磷浓度处理下的叶绿素含量，结果(见图5(a))发现，相同磷浓度处理时，转基因拟南芥的叶绿素含量较野生型均有增加．其中，50,μmol/L和500,μmol/L低磷胁迫下，转基因拟南芥叶绿素含量比野生型分别提高了27.3 %,和18.8 %,，差异极显著．

花青素积累造成植物茎秆或叶片颜色加深，是植物最明显的缺磷症状．相同磷浓度处理条件下，转基因拟南芥的花青素含量较野生型均有降低．其中，50,μmol/L低磷胁迫下，转基因拟南芥花青素含量比野生型降低了9.9%,，差异显著．上述结果表明，在拟南芥中过量表达基因能显著降低拟南芥受低磷胁迫的影响．

同时发现，随着培养基中磷浓度的降低，转基因拟南芥与野生型中无机磷、有机磷、总磷的含量虽都有降低，但是转基因拟南芥中磷含量较野生型高．0,μmol/L缺磷处理时，转基因拟南芥中总磷、无机磷和有机磷含量较野生型差异均不明显；50,μmol/L和500,μmol/L低磷处理时，转基因拟南芥中总磷、无机磷和有机磷含量均显著高于野生型，差异极显著．这些结果表明，基因提高了拟南芥在低磷环境中对基质中磷的吸收和利用能力，从而改善了植株的磷营养状况．

图5 不同磷浓度处理5,d后35S：ThPHT1;8转基因拟南芥生理指标分析

3 讨 论

磷酸转运蛋白是植物吸收磷素的主要介质，植物通过磷酸转运蛋白将外界无机磷转化为能够被植物吸收和利用的有效磷[4]．低磷条件下，植物从土壤中吸收磷以及植物体内磷的转运均主要依靠定位于细胞膜上的高亲和力磷酸转运蛋白基因家族调节[4].

比较基因组学是在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因和基因结构进行比较，发现新基因并预测其功能、表达调控机制及物种间进化关系的学科．近年来，在模式植物全基因组测序的基础上，利用比较基因组学的方法，国内外学者已鉴定出数十个编码磷转运蛋白基因家族成员，并对其功能及表达模式进行了探讨[5]．拟南芥基因家族含9个成员，除了基因在花内大量表达外[28]，其余8个基因不仅在根部表达，而且在受低磷胁迫时增加转录水平[28-30]．Mudge等[28]通过对和两个基因的启动子分析，发现这两个基因不仅负责调控植物根系从土壤溶液中吸收磷，并且调节植物体内磷素向维管组织转运的基本过程，、、和在从磷源到植物组织的磷酸转运过程中也都起了重要作用[9-10,12,31]．植物家族成员通过复杂的分子调控网络来调控磷酸转运蛋白的表达[4]，受低磷胁迫后，高亲和力磷酸转运蛋白基因被诱导并优先在植物根部表达，正常磷条件下，高亲和力磷酸转运蛋白表达迟缓．这表明基因可以在低磷条件下发挥积极的作用，在响应环境胁迫和维持体内磷动态中起重要作用．

前人研究结果表明，PHT1家族成员是高亲和力磷酸转运蛋白[4-19]．已克隆PHT1家族成员的生物信息学研究表明，PHT1各家族成员之间保守性很强，蛋白分子质量58,ku左右，含有520～550个氨基酸残基，大多数含12个疏水的跨膜结构域，而且第6个和第7个跨膜域之间被一个亲水大环分隔成2组[4,8].本研究利用生物信息学手段和比较基因组学的方法，从盐芥中克隆了一个与拟南芥基因高度同源的磷酸转运蛋白基因，命名为ThPHT1;8蛋白含有525个氨基酸残基，蛋白分子质量为58.1,ku，等电点6.33，是一个定位在细胞膜上疏水性、无信号肽的非分泌性蛋白，含有高亲和力磷酸转运蛋白典型的12个跨膜域和一个大亲水环的跨膜结构．实时定量PCR结果表明，低磷胁迫能显著促进基因在盐芥根部的表达，不同磷浓度处理下基因的表达水平不同，说明盐芥基因不仅参与盐芥对低磷胁迫的应答，而且对不同磷浓度胁迫有不同的应答机制．

根系是植物吸收、利用土壤磷的主要器官．研究发现，植物能够根据土壤中磷的分布及有效磷含量来调控根系形态[1]．在低磷情况下，植物将能量向根系转移，促进根系生长，侧根密度均会有显著增加[2-3].现有的研究结果表明，大多数基因家族成员主要在根部表达，且受低磷诱导增强表达，如拟南芥根部检测到8个基因的表达，其中，、和在根表皮细胞和根毛细胞中高水平表达[28-30]，说明基因家族成员在植物根系吸收和转运磷的过程中可能具有重要作用．本研究中，将盐芥基因在拟南芥中过量表达，分析不同浓度低磷胁迫处理下转基因拟南芥的根系形态，发现与野生型相比，转基因拟南芥幼苗的主根根长有显著提高，侧根密度下降，这与他人的研究结果一致．

磷元素是植物生长发育所必需的矿质元素之一，几乎影响植物所有的生理生化过程．低磷条件下，植物除了在根系形态方面产生适应外，体内一些生理生化过程也会发生变化．叶绿素是与植物光合作用密切相关的色素，逆境胁迫下植物光合作用减弱，体内叶绿素含量降低．花青素是一种广泛存在于植物中的水溶性色素，花青素积累造成植物茎秆或叶片颜色加深，是植物最明显的缺磷症状之一．因此，叶绿素和花青素含量的变化在一定程度上可以反映植物抗低磷胁迫的能力．本研究中，分析不同浓度磷处理下转基因拟南芥叶片的叶绿素含量，发现在相同低磷条件下，转基因拟南芥的叶绿素含量均高于野生型，花青素含量较野生型均有降低．这说明盐芥基因转化拟南芥后，提高了拟南芥植株在低磷胁迫下的适应性，降低了拟南芥受低磷胁迫的影响，可能是由于提高了转基因拟南芥对基质中磷的吸收和利用能力，从而改善了植株的磷营养状况．本研究中，50,μmol/L和500,μmol/L低磷处理时，转基因拟南芥中总磷和无机磷含量较野生型增加20%,左右，差异极显著．上述结果表明，盐芥基因能够提高转基因拟南芥的耐低磷能力，为土壤磷高效利用型植物分子育种提供了一种有潜力的候选功能基因．

4 结 语

本文以盐芥幼苗根部所提取的RNA为材料，克隆到盐芥磷酸转运蛋白基因．生物信息学分析结果表明，ThPHT1；8蛋白共525个氨基酸残基，蛋白分子质量为58.1,ku，等电点6.33，属于疏水、无信号肽的非分泌蛋白，定位在细胞膜上，含高亲和力磷酸转运蛋白典型的12个跨膜域和一个大亲水环．实时定量PCR结果表明，低磷胁迫能显著促进基因在盐芥根部的表达，而且对不同磷浓度胁迫有不同的应答反应．基因在转基因拟南芥中的研究表明，不同浓度低磷胁迫处理下，与野生型相比，转基因拟南芥幼苗的主根根长增加，侧根密度降低，叶绿素含量、无机磷和总磷含量提高，花青素含量降低．上述结果表明，盐芥基因能够提高转基因拟南芥的耐低磷能力，为高效利用土壤磷提供了一种有潜力的候选功能基因．

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(责任编辑：田 军)

Cloning and Function Analysis of ThPHT1;8,Gene inThellungiella Salsuginea

Yang Shaohui，Li Shuang，Kou Yingying，Wang Jiehua，Song Yingjin，Guan Chunfeng

(School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300350，China)

Phosphorus(P) is one of the most limiting mineral nutrients for plant growth and development. In plants，the uptake from soil and intercellular transport of inorganic phosphate(Pi) are mediated by the PHT1 family. In this work，we obtained the ThPHT1;8 gene through cloning from cDNA of Thellungiella salsuginea seedings roots. Bioinformatics analysis indicated that ThPHT1;8 protein had 525 amino acid residues. The molecular weight of the protein was 58.1 ku and the isoelectric point was 6.33. It was a hydrophobic and non-secreted protein with no signal peptide. ThPHT1;8 possessed the major characteristics of high-affinity phosphate transporters，such as transmembrane structure. Real-time quantitative PCR showed that the expression of ThPHT1;8 was strongly enhanced by low phosphorus stress in roots of Thellungiella salsuginea and the patterns of expression were different under different phosphorus stresses. The biological function of ThPHT1;8 gene indicated that 35S：ThPHT1;8 transgenic Arabidopsis had longer primary roots and less lateral root density than wild-type Arabidopsis under deficient phosphorus conditions. The contents of inorganic phosphorus，total phosphorus and chlorophyll increased in the 35S：ThPHT1;8 transgenic Arabidopsis，but the content of anthocyanin decreased. To conclude，ThPHT1;8 could enhance the tolerance of plants to low environmental phosphorus and improve transgenic Arabidopsis resistance to low phosphorus capacity. The study offers a functional candidate gene for efficient utilization of soil phosphorus.

Thellungiella salsuginea；phosphate transporters；bioinformatics；ThPHT1;8 gene

10.11784/tdxbz201704023

Q785

A

0493-2137(2018)04-0380-09

2017-04-10；

2017-05-08.

杨少辉（1992—），女，博士，副教授，shaohuiyang77@tju.edu.cn.Email：m_bigm@tju.edu.cn

李 爽，lish1128@163.com.

2017-06-14.

http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1127.N.20170614.0909.002.html.

转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX0800404B)；天津市应用基础与前沿技术研究计划资助项目(15JCQNJC14700)．

the National Transgenic Major Project of China(No.,2014ZX0800404B)and the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(No.,15JCQNJC14700).