白屈菜对低温胁迫应答的生理学研究及分子机制解析

赵　露，杨雪梅，李　俊，刘　霞，许永华

(吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118)

白屈菜(ChelidoniummajusL.)是罂粟科白屈菜属多年生草本植物，全草入药，富含多种生物碱，有止咳、抗炎、止痛等多方面药理作用，[1-6]是止咳、胃肠消炎及止痛类中药制剂的重要原料[7].在对白屈菜驯化栽培的研究中发现，白屈菜对生态环境有比较广泛的适应性，对土壤酸碱性、强光和荫蔽环境、干旱及温度变化的适应性较强，特别是抗寒冻性极强，在冬季气温-50℃以下的地区(如内蒙古根河市)，其莲座状丛生叶及当年种子萌发的幼苗可以自然越冬，并在翌年初春冰雪尚未完全融化时，叶片由水渍状回复成正常状态开始生长，是冬性植物.白屈菜极强的耐寒冻特性机理目前在国内外尚未见报道.

植物抗寒性研究表明，环境因素和物种生物学特性是影响植物抗寒冻性的关键因素，环境因素主要是温度、光周期、水分状况[8]；物种生物学特性主要由植物遗传背景、发育和生长时期以及植物对低温胁迫的保护机制所决定[9].植物在适应寒冻胁迫过程中，启动抗寒冻机制以减少低温造成的损伤，出现一些显著的生理生化变化：保护性物质增多，调节细胞渗透性并降低冰点温度[10-15]；含水量下降，呼吸代谢减弱[16]；激素调控系统发生变化，如内源激素中IAA、GA浓度下降，ABA浓度升高，以抑制生长促进休眠[17]；细胞质膜氧化性发生变化等[17-19].目前，对植物感知低温信号的研究表明，组蛋白H2A.Z可能参与拟南芥的温度感知；三磷酸肌醇(IP3)介导的Ca2+信号转导途径可能在低温信号转导中起决定作用；磷脂酶D、脂肪酸去饱和代谢关键酶以及肌醇多磷酸磷酸酶基因FRY1等与低温信号感知有关.[17]对低温胁迫应答的分子机制研究表明，C-复制-结合因子/脱水反应元素结合因子(CBF/DREB1，C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding factor1)调控途径具有保守性，在多种双子叶和单子叶植物中均发现了该关键基因参与的调控，[17]揭示在单子叶植物中存在类似于拟南芥的CBF/DREB1 调控机制[20].此外，植物中还存在其他的低温信号传递通路[17].

迄今，有关白屈菜抗寒冻性的研究未见报道，其应答低温胁迫的生理生化反应以及低温应答分子机制尚不清楚，因此，本文对此开展了相关研究，以探究其超强抗冻性的生理基础和分子机制.

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1采样

野生白屈菜采自吉林农业大学校园内野生白屈菜1号观测样地，样地的地理位置为北纬43°48′33″、东经125°24′21″，海拔230 m；夏季林间郁闭度在85%左右，木本植物有银中杨、红皮云杉，草本植物有紫花地丁、早开堇菜.8月初白屈菜茎枯萎、根盘萌发新的基生叶，待基生叶长到8 cm左右开始采样，持续到12月末气温降至-20℃以下.夏秋季采样温度范围10℃～28℃，林下日照时间8～12 h，采样时间为当日14：00，即日间温度最高时段.秋冬季采样温度范围-25℃～10℃，林下日照时间0～8 h(积雪覆盖后越冬苗日照时间为0 h)，以每日最低温连续3 d达到采样低温时开始采样，采样低温设定为5℃，0℃，-5℃，-10℃，-15℃，-20℃，采样时间为当日8：00.分别从3株植株采集叶片.

1.1.2控制降温条件下的实验材料

控制条件下生长的白屈菜，是将上述1号观测样地的白屈菜苗及根际周围土壤一起移植到营养钵中，放入人工气候箱，25℃、16 h光照8 h黑暗适应培养1周后，将培养温度分别设定为25℃，20℃，15℃，10℃，5℃，0℃，每一温度点维持3 d，在各温度点采样.-5℃，-10℃处理在冰箱中进行，全黑暗，每个温度点维持3 d.采样时分别从3株植株取叶片.

1.1.3转录组测序及基因验证材料

材料来源及采样方法同1.1.1，采样温度为0℃，-10℃，-20℃，分别命名为A、B、C三组，每组分别从3株野生白屈菜植株上取叶片.基因验证用测序的3份平行材料.

1.2　实验方法

1.2.1主要生理指标测定

细胞膜渗透性——相对电导法；游离脯氨酸——酸性茚三酮比色法；丙二醛——硫代巴比妥酸法(TCA法)；可溶性糖——蒽酮乙酸乙酯比色法；可溶性蛋白——考马斯亮蓝法；叶绿素含量——比色法.每份样品取白屈菜叶片0.3 g，3次重复.采用IBM SPSS Statistics22软件对生理实验数据进行差异性分析.

1.2.2转录组测序

委托上海欧易生物医学科技有限公司进行测序及数据库比对.测序平台：IlluminaHiSeqTM 2500测序仪，文库质检：Agilent 2100分析仪；每样本数据量为6 G，数据解析包括非冗余数据库(NR，non-redundant)、真核生物同源蛋白数据库(KOG)、蛋白质数据库(SWISSPROT)、基因数据库(GO，gene ontology)、基因与基因数据库(KEGG，Kyoto encyclopedia of genes and genomes)等5个数据库比对及差异表达基因筛选.

1.2.3基因表达验证

采用实时定量PCR法进行基因表达验证.RNA逆转录试剂采用Vazyme公司生产的试剂盒(产品代码R223-01)，荧光定量PCR试剂采用Qiagen公司生产的定量PCR试剂盒(QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit)；仪器：LightCycler® 480 ⅡPCR仪(Roche).

2　结果与分析

2.1　野生白屈菜低温应答过程中主要生理指标变化趋势

植物感受低温刺激启动生理应答，细胞内抗寒冻性物质脯氨酸、可溶性糖(蔗糖、葡萄糖)、可溶性蛋白含量增加，细胞渗透性改变、叶绿素含量降低[21].测定秋冬季野生白屈菜应答低温的主要生理指标、各化合物含量以及电导率的变化可反映在降温过程中白屈菜的生理状况.

野生白屈菜在降温过程中，与低温应答相关的主要生理指标的变化趋势见图1.其中，细胞内抗寒冻性物质，如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等，在5℃～0℃寒害发生时含量开始升高；在0℃～-5℃时，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量急剧升高，-5℃时几乎达到最大值.与此同时，由于脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量增加，细胞内自由水含量降低，细胞的相对电导率显著降低，在-5℃时达到最低值，即细胞渗透性最低，表明细胞已经完成低温驯化，获得了抗冻性.在-5℃～-20℃时，植物代谢水平降低，脯氨酸和可溶性糖含量降低，细胞内溶液浓度降低，相对电导率呈上升趋势，细胞渗透性增大，提示可能由于细胞内或细胞间隙冰晶形成造成膜损伤，导致电导率升高.在-5℃～-20℃时，细胞中可溶性蛋白含量升高，达到12 mg/g，推测可能是0℃以下低温诱导产生的抗冻蛋白.

丙二醛是逆境胁迫时植物细胞膜脂被活性氧氧化的产物，其含量高低反映细胞膜脂过氧化以及细胞膜损伤的程度.丙二醛能引起细胞膜功能紊乱，破坏细胞中酶、蛋白质以及核酸等分子结构.白屈菜在25℃～0℃的降温过程中，丙二醛含量显著提高，25℃时丙二醛含量是0.002 μmol/g，而0℃时是0.020 μmol/g，是前者的10倍.在-5℃和-15℃时，丙二醛含量分别是0.020 0和0.017 9 μmol/g，表明白屈菜低温应答过程中细胞膜氧化程度显著提高.而-20℃时，丙二醛含量显著下降，推测可能与抗冻蛋白增加有关.

叶绿素含量降低是植物应答低温的普遍规律.白屈菜在25℃～-20℃的降温过程中，叶绿素含量呈下降趋势，反映出光合色素分解、光合作用减弱直至停止的生理状态.

以正常生长温度25℃样本组为对照，对各温度组野生白屈菜的生理指标进行了差异显著性分析，结果表明，脯氨酸含量25℃组与其他各温度组有极显著差异，25℃组以外的各温度组间没有极显著差异.可溶性糖含量25℃组与0℃，-5℃，和-10℃组间存在极显著差异；0℃组与-5℃，-10℃组间也存在极显著差异，说明0℃以下的低温对可溶性糖的积累影响显著.可溶性蛋白含量25℃组与-5℃，-10℃，-15℃，-20℃组间均存在极显著差异.细胞相对电导率5℃组与-5℃，-10℃，-15℃组间存在极显著差异.丙二醛含量25℃组与0℃，-5℃，-10℃，-15℃组间均有极显著差异.叶绿素含量25℃组与-20℃组间有极显著差异.

图1　低温应答时野生白屈菜主要生理指标变化趋势

2.2　白屈菜应答低温生理反应的实验验证

在固定光照强度、光照时间的人工气候箱中，控制降温，测定白屈菜在此过程中主要生理指标的变化情况，并与野生白屈菜在降温过程中生理指标的变化进行比较分析，以确定白屈菜低温应答过程的生理状态，结果见图2.

在15℃～0℃的低温驯化阶段，人工控制栽培的白屈菜抗寒冻性物质脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量开始增加(见图2(a)—(c))，但增加幅度较小，如可溶性糖增加幅度小于野生白屈菜在这一温度区间的变化值.在0℃～-5℃时，栽培白屈菜脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量变化趋势与野生白屈菜相同，-5℃时几乎均达到最大值，分别是0.721 5，49.043 1，3.648 9 mg/g，但绝对值小于野生白屈菜.-5℃～-10℃时，脯氨酸和可溶性蛋白含量呈下降趋势，而可溶性糖含量略有升高，在这一区间，脯氨酸的变化趋势与野生白屈菜相同，可溶性糖和可溶性蛋白的变化趋势与野生白屈菜相反.

栽培白屈菜相对电导率在25℃～5℃降温阶段变化比较平稳，变化范围在6.920 8%～3.183%之间(见图2d)，与脯氨酸的变化趋势相关，反应在这一温度区间渗透调节物质脯氨酸对相对电导率的影响较大.0℃时，相对电导率升高到8.978 7%，此时脯氨酸虽略有升高但可溶性糖含量较之前显著下降，表明随着温度降低白屈菜的光合作用减弱甚至停止，糖分积累减少，显著影响细胞质浓度，导致相对电导率升高.-5℃～-10℃阶段，处于周期性光照、无保护的叶片受到冷冻损伤，细胞相对电导率急剧升高，达到31.990 9%，此时渗透调节物质脯氨酸和抗冻蛋白含量升高，但可溶性蛋白含量显著小于无光照条件下的野生白屈菜，提示光照可能影响0℃以下低温对抗冻蛋白的诱导表达.

在固定的光周期和控制降温条件下，丙二醛在15℃～-10℃降温阶段含量变化范围为0.007 708～0.011 692 μmol/g，是正常生长温度时的1.5～2.0倍，表明细胞膜氧化性提高.控制降温过程中，尽管维持一定的光照周期，但随着温度降低，叶绿素含量呈下降趋势，这种变化与野生白屈菜相同.

以25℃组样本做对照，对各温度组白屈菜的生理指标做差异显著性分析，结果表明，在完全控制的降温过程中，脯氨酸含量25℃组与-5℃，-10℃组间存在极显著差异.可溶性糖含量25℃组与10℃，5℃，-10℃组间存在极显著差异.可溶性蛋白含量，20℃组与其他温度组间均存在极显著差异，而其他各温度组之间没有显著差异.相对电导率-5℃，-10℃组分别与0℃以上(含0℃组)各温度组间存在极显著差异.丙二醛含量25℃组与5℃，-10℃组间有极显著差异.叶绿素含量25℃组与15℃以下(包括15℃组)各组间存在极显著差异.

图2　控制栽培白屈菜应答低温时主要生理指标变化趋势

2.3　白屈菜低温应答分子机制分析

如1.1.3方法所述取样，每个温度点设3个生物学重复，进行转录组测序，数据经质量分析及筛选、数据库比对，共获得长度300 bp以上的基因序列(Unigene，universal gene)113 504个，平均每组有9 586 个Unigene显示为差异表达基因，包括上调表达基因4 509个、下调表达基因5 077个.与NR、SWISS-PROT、KOG、 KEGG和GO等数据库进行比对，被注释的Unigene分别为58 302，41 251，34 296，14 031和36 490个，注释比例分别为51.37%，36.34%，30.22%，12.36%和32.15%.

与GO数据库比对后，注释基因分组如图3所示(图3为转录组数据分析系统自动生成).Unigene被大量注释到生物过程类别的“细胞过程”“代谢过程”“生物过程的调控”，细胞组分类别的“细胞组分”“细胞膜组分”及“细胞器组分”，分子功能类别的“催化活性”“分子结合功能”及“转运活性”.

样本间差异表达基因分组中“细胞过程”“代谢过程”“生物过程的调控”变化与生理指标脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量变化趋势相吻合，“细胞组分”变化与冻害发生时可溶性蛋白含量变化趋势相吻合.“细胞膜组分”中重要生理指标丙二醛也发生显著性变化.

图3　GO注释统计图

对A(0℃)、B(-10℃)、C(-20℃)3组样本间差异表达基因进行GO富集分析，结果见图4(图4为转录组数据分析系统自动生成).由图4可见，图4(a)表达差异显著的前5类基因分别是质外体、细胞壁、质膜、膜的锚定组分、质膜的锚定组分；图4(b)两样本间差异显著的前5类基因分别是质外体、细胞壁、质膜、胞外基质、胞外区；图4(c)表达差异显著的前5类基因分别是叶绿体类囊体膜、叶绿体、类囊体、叶绿体类囊体、叶绿体基粒.

样本B与样本A比较(见图4(a))，主要在膜成分上出现差异，提示膜的渗透性、氧化性发生变化，与生理测定的相对电导率、丙二醛等物质的变化趋势一致；样本C与样本A比较(见图4(b))可见，细胞外基质和细胞外区域发生显著变化，与电导率变化趋势一致，提示植物在冻害胁迫时，可能由于膜损伤细胞内容物渗出导致细胞外部出现变化.样本C与样本B比对(见图4(c))可见，变化全部显示在叶绿体及类囊体上，提示冻害胁迫时叶绿体受到损伤，与生理实验中叶绿素的变化趋势一致.

(a)样本B与样本A的比对结果；(b)样本C与样本A的比对结果；(c)样本C与样本B的比对结果

2.4　野生白屈菜低温应答相关基因的表达验证

从样本间差异表达基因中选取7个与脯氨酸合成代谢有关的基因、7个与低温响应相关的转录因子基因进行基因表达量的再次验证，以检验转录组测序结果的准确性及生理生化指标变化趋势的准确性.筛选的目标基因见表1.

基因相对表达量验证结果如图5所示.图5结果显示，与脯氨酸合成及代谢相关的基因在A(0℃)组样本中表达量高，在B(-10℃)组样本中多数表现为下降，在C(-20℃)组样本中除脯氨酸脱氢酶和鸟氨酸-氧合酸转氨酶基因外，其他基因表达量相似或较B组降低，表明脯氨酸作为渗透调节物质，主要在低温胁迫前期发挥作用.转录因子CBF4/DREB1d、MYB44、ZAT10等在0℃时表达量较高，在-10℃，-20℃时表达量降低，表明其在低温胁迫早期起调控作用，而ERF5(ethylene responsive factor 5)、ICE1(inducer ofCBFexpression 1)、WRKY40等在-20℃组表达量显著上升，表明其在冻害胁迫时作用活跃，可能与抗冻蛋白的合成密切相关.

表1　目标基因名称及基因库ID编号

图5　脯氨酸合成代谢相关基因、低温应答转录因子基因相对表达量验证

3　讨论

植物抗寒性的获得与温度、光周期密切相关[22].野生白屈菜在秋冬季来临时，林下光照时间逐渐缩短，气温在5℃～0℃时，光照时间不足12 h；0℃～-10℃时，光照时间为9～10 h；气温降至-15℃～-20℃时，光照时间仅8～9 h，或由于积雪覆盖，植株完全得不到光照，因此，野生白屈菜在低温和光周期双重作用下，较早地启动低温应答反应，渗透调节物质及抗冻物质等主要生理指标较早发生变化.而在人工控制条件下生长的白屈菜，尽管温度不断下降，但光照周期始终保持在12 h光照、12 h黑暗，且光照强度保持1 500 lx不变.恒定的光照周期及光照强度一定程度上延迟了白屈菜对低温的响应反应，与低温应答相关的主要生理指标较野生白屈菜变化要晚.我们的实验结果显示，野生白屈菜大约在5℃即开始启动抗寒冻机制，生理指标变化显著，比控制生长的白屈菜启动应答温度要高，在同样的温度条件下，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量高于人工气候箱中生长的白屈菜.这一结果也证明，在相同的温度条件下，光照降低了植物的抗寒性，短日照导致植物抗寒能力增强.对其他植物的相关研究也证明，人为改变短日照为长日照的处理会影响抗冻锻炼效果，植物抗冻能力下降.-5℃时两种材料的相对电导率值也证明光照影响植物抗冻性的获得，造成细胞损伤.

在控制降温条件下生长的白屈菜丙二醛含量小于野生白屈菜的，说明在光照条件下，低温驯化效果被部分消除，叶绿体功能得到恢复，活性氧被消除，使膜脂过氧化产物丙二醛含量降低.控制条件下生长的白屈菜叶绿素含量范围高于野生白屈菜，这也可以证明叶绿体没有完全损伤，功能依然存在.

基因表达验证结果表明，7个与脯氨酸合成及代谢有关的基因在低温胁迫的早期及寒害发生时作用活跃，细胞组分中脯氨酸含量升高，这一变化趋势与生理指标的测定结果相吻合.在-20℃时，与低温应答相关的转录因子如ERF5、ICE1、WRKY40及RAV1的表达量显著升高，这些转录因子在抗冻蛋白的合成中发挥直接或间接的调控作用，促进抗冻蛋白的诱导合成，这一结果与冻害胁迫时细胞中可溶性蛋白含量升高相吻合.因此，实验从分子机制上初步阐明了白屈菜抗寒冻性的生理基础.

本文首次报道了白屈菜的抗寒性和应答低温胁迫的生理生化基础，并首次基于白屈菜应答低温的转录组数据，分析、验证并初步揭示了其低温应答过程的分子机制，为今后发现并利用有价值的抗寒基因奠定了基础.

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