环状RNA研究进展

刘新红

（重庆第二师范学院生物与化学工程学院，重庆 400067）

过去数十年间，从真核生物中发现的具有功能的非编码RNA种类不断增多。随着高通量测序技术和生物在信息学的发展，环状RNA（Circular RNA，circRNA）作为非编码RNA家族重要成员逐渐走进人们的视野，其生物学特性和调控功能也已成为当前研究的热点。1976年，Sanger等[1]利用电子显微镜在植物感染的类病毒（Viroids）及副流感病毒（Sendai virus）颗粒中首次观察到共价闭合环状RNA分子，这是circRNA的首次发现和命名。随后，研究人员相继在小鼠、猴子、猪、人等物种中发现了circRNA。然而，由于它们丰度低、特征不常见，这些RNA仅仅被当作是异常剪接产物，并没有引起广泛的重视。直到2012年，Salzman J等[2]通过人类小儿急性淋巴细胞白血病样品的RNA测序数据库，发现了circRNA在人类细胞的普遍表达，基于此数据库发现人体内大约有10万个circRNA，人们才开始重新认识并深入研究这一热点新星。

1 circRNA的形成机制

大部分circRNA起源于蛋白质编码基因的外显子，通常由1～5个外显子组成。根据生物发生的来源不同，circRNA可以分为4种类型，分别是外显子circRNA（ExoniccircRNAs，ecRNAs）、内含子circRNA（IntroniccircRNAs, ciRNAs）外显子-内含子 circRNA（Exon-intron circRNAs，EIciRNAs）、基因间 circRNA（IntergeniccircRNA）[3]。

关于circRNA的生物发生，目前已经提出两种假说，分别是“内含子配对驱动环化”（直接反向剪接）和“套索驱动环化”（外显子跳读），当前主流观点认为反向剪接机制在circRNA的生物发生过程中起重要的调控作用[4]。反向剪接机制过程是下游外显子的3＇端反向与上游外显子5＇端共价连接形成闭合环状结构，经过内含子切除过程形成外显子circRNA或者不经内含子切除过程直接形成外显子-内含子circRNA。外显子跳读机制的过程是，前体mRNA（pre-RNA）经过经典剪接，形成外显子被跳读的线性RNA和被跳读部分形成套索结构，套索结构中内含子被切除形成外显子circRNA或不被切除直接形成外显子-内含子circRNA。以上两种机制既有相似之处，也有各自特异的环节。直接反向剪接和外显子跳读这两种机制第一步是不同的：直接反向剪接是由2个内含子互补配对结合，从而形成环状结构；而外显子跳读则是由外显子组成的剪接供体（Splice donor）和剪接受体（Splice acceptor）共价结合。而在接下来的步骤中，这两种机制的过程基本一致，即剪接体（Splicesome）切除剩余内含子和形成外显子circRNA或不切除剩余内含子形成外显子-内含子circRNA。

研究表明，部分内含子在经典剪接过程中也会形成套索结构，但这一套索结构会很快在脱支作用下被降解。Zhang等[5]发现，分支点附近11个C富集基序和5＇端剪接位点附近7个GU富集基序这一特殊的核酸序列对于内含子circRNA的生物发生至关重要。这一特殊核酸序列可能特异性的参与内含子circRNA的生物发生，因为它在外显子circRNA和其他类型circRNA的生物发生过程中并不富集。

2 circRNA的生物学功能

随着环境日益恶化、社会发展带来的巨大生活压力，癌症已成为威胁人类健康的第一大杀手。癌症发生最重要的一个原因是细胞内基因组紊乱，基因发生融合，进而产生具有有害功能的融合蛋白。而基因组紊乱的同时，circRNA也发生融了，并进一步促进基因组的紊乱以及有害融合蛋白的产生。深入研究circRNA的生物学功能，就显得尤为迫切。

随着circRNA研究的不断深入，目前普遍认为circRNA在基因表达调控方面具有重要作用，如作为miRNA、蛋白的海绵、转录和转录后调控的转录因子等。最近的发现还显示circRNA可以翻译成一些短肽。

2.1 circRNA作为miRNA的海绵

miRNA是一种约22个核苷酸长的非编码RNA，通过特异结合靶标基因非编码区，进而对靶标基因进行转录后调控。Salmena L等[6]2011年提出竞争性内源RNA（ceRNA）假说，认为mRNA、假基因和lncRNA之间通过miRNA反应元件构建一个大规模的调控网络，其中lncRNA可以作为miRNA的海绵发挥作用。与其他ceRNA相比，circRNA具有更好的miRNA亲和力，因此circRNA也被称为“超级海绵”。circRNA作为miRNA海绵最好的一个例子是ciRS-7，包含74个能够与miRNA-7有效结合的保守位点，ciRS-7与miRNA-7的共存也已经被免疫共沉淀实验证明。当ciRS-7过表达时，能大量结合miR-7而导致miR-7靶基因的表达水平上升；而当抑制ciRS-7表达时，miR-7靶基因的表达水平会降低。相似地，在斑马鱼胚胎中过表达ciRS-7会导致中脑容量变小，与敲除miR-7后的表型一致，也证明了ciRS-7对miR-7的海绵作用。

2.2 circRNA作为蛋白的海绵

一些线性非编码RNA可以与RNA结合蛋白（RBP）相互作用进而发挥其生物学功能，故猜测circRNA的功能也包括与RNA结合蛋白相互作用。Guo等[7]通过体内交联高通量测序实验，收集得到20个RNA结合蛋白的数据库，发现环化外显子的聚集密度略高于其临近外显子的密度，暗示circRNA可能与RNA结合蛋白结合。因其自身固有的稳定性，circRNA可以作为RNA结合蛋白的“脚手架（scaffolding）”，聚集多种蛋白并促进这些蛋白之间的相互作用。例如circ-Foxo3可以与p21和周期素依赖激酶CDK2结合，形成circ-Foxo3-p21-CDK2三原复合物，影响CDK2的生物学功能和细胞周期的进展[8]。

2.3 circRNA的转录调控

circRNA可以形成一大组转录和转录后调控因子，其直接参与基因表达调控的作用已经在多项实验中被证实。EIciRNA和ciRNA大量存在于细胞核内且具有很少的miRNA结合位点，敲除这些circRNA可以导致其亲本基因表达量显著降低。例如，circEIF3J或circPAIP2可以与其相应的亲本基因和U1小核核糖核蛋白颗粒（U1 snRNP）共存，通过U1 snRNP促进RNA聚合酶Ⅱ的聚集进而调控亲本基因的表达[9]。

2.4 circRNA的蛋白翻译

早期的研究报道大多数circRNA不能与核糖体相互作用，导致产生circRNA不太可能翻译蛋白的观点。随着研究的不断推进，研究人员发现作为circRNA线性对应物的lncRNA能编码一些低保守性的短肽，所以推测circRNA也可以翻译形成蛋白，而这一推测也被后续实验所证实。研究表明，当circRNA含有内部核糖体进入位点（IRES）或原核核糖体结合位点时，就可以在体内或体外翻译成短肽[10]。例如，Pamudurti NR等[11]发现果蝇体内一部分circRNA可以以不依赖于5＇端帽子结构的方式进行翻译，编码至少一个核糖体-circRNA特异性结构域。类似的，Legnini等[12]在小鼠和人成肌细胞中发现，circ-ZNF609的开放阅读框在环化时会产生一个与线性转录本相同的起始密码子和终止密码子，以不依赖于5＇端帽子结构的方式翻译产生蛋白，但是这个蛋白的活性需要进一步的实验进行检测。最近，Yang等[13]的实验表明，N6-腺苷酸甲基化（m6A）基序在许多circRNA中富集，并促进不依赖于5＇端帽子结构翻译的开启。

3 结论

随着对circRNA研究的不断深入，circRNA的重要作用也日益凸显。最近研究表明circRNA可以作为ceRNA,竞争性结合miRNA、部分蛋白，对基因表达进行转录后调控。这种ceRNA调控模式及circRNA自身的表达在真核生物中均具有较高稳定性，这使他们具有作为标志物检测相关疾病的应用前景。此外，circRNA与miRNA、部分蛋白的定向结合能力也暗示我们，在精准医学的时代，circRNA一定会在免疫治疗方面发挥重要作用。进一步阐明circRNA的ceRNA调控网，使其为疾病治疗效力，都只是时间问题。circRNA的存在及功能拓展了真核生物转录组的复杂性和多样性，本文重点对circRNA的生物发生进行了整理汇总，同时为更好地了解与治疗人类疾病提供理论依据与技术指导。