Dot1及其同源物的研究进展

李呈贞(综述) 韩振格 何东仪(审校)

(1上海市长宁区光华医院检验科 上海 200052; 2上海市中医药研究院中西医结合关节炎研究所 上海 200052)

在低等真核生物中催化H3K79甲基化的赖氨酸甲基转移酶被称为Dot1(disruptor of telomeric silencing 1)。在哺乳动物中保守的同源蛋白被称为Dot1样蛋白(Dot1-like,DOT1L)。在酿酒酵母、果蝇和人类中,Dot1/DOT1L被认为是催化H3K79甲基化的唯一甲基转移酶。研究发现DOT1L与染色质沉默、基因表达调控、DNA损伤修复、细胞周期调控、胚胎发育、白血病的发生发展等多种生物学过程有密切的联系[1],DOT1L已成为针对表观遗传修饰因子的重要药物靶点,本文对Dot1/DOT1L在生理和病理方面的研究进展作一综述。

Dot1/DOT1L活性及其调控

H3K79甲基转移酶活性 组蛋白甲基化由一组组蛋白甲基转移酶催化完成。基于其催化结构域,赖氨酸甲基转移酶迄今可分为两类。第1类包含进化上保守的SET结构域,第2类不具备SET结构域,仅包含一个进化上保守的蛋白质DOT1(端粒沉默干扰物)和其同源物。DOT1及其同源物含有与Ⅰ类甲基化酶相似的甲基转移酶催化结构域[2]。

Dot1是一种进化上相对保守的组蛋白甲基转移酶。DOT1家族都包含一个4个模体(motif)的保守区域[2]:Ⅰ、post Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。酵母Dot1(yDot1)和人类同源蛋白DOT1L(hDot1L)的晶体结构显示,它们都拥有一个开放的α/β结构,此结构包含了1个Ⅰ类SAM依赖性甲基转移酶的典型结构——7股β片段[3-4]。 由于DOT1的结构和精氨酸甲基转移酶相似[5-6],因此猜测DOT1也能催化精氨酸甲基化。然而,使用逆相高效液相色谱(HPLC)等方法都未能证明DOT1具有精氨酸甲基转移酶活性[5]。因此,尽管人类和酵母DOT1蛋白在结构上更类似于精氨酸甲基转移酶,但DOT1家族不能完成精氨酸甲基化修饰。

2002年,几个小组分别采用不同的方法发现,组蛋白H3的球状结构域中的第79位赖氨酸即H3K79容易甲基化,而yDot1和hDot1L正是催化这一反应的酶[5,7]。有研究通过选择性剪切和表达序列标签分析确定了5个小鼠Dot1 mRNA(mDot1a-mDot1e),其中mDot1a与人类Dot1蛋白(hDot1L)同源性最高,有84%的氨基酸序列相一致,且相似性高达88%,同时研究还证实mDot1a在体内具备特异性催化H3K79甲基化的酶活性[8]。Dot1及其同系物几乎全权负责H3K79甲基化,在酵母、果蝇和老鼠中敲除Dot1会导致H3K79甲基化完全丧失[5-6,9]。

影响Dot1/DOT1L表达和H3K79甲基化的因素 ENCODE全基因组甲基化测序数据显示,DOT1L基因启动子区CpG岛在人类各种组织中均呈现极低的DNA甲基化水平,说明其在人类组织中广泛表达。然而,在小鼠早期胚胎着床前发育时DOT1L mRNA水平呈低转录水平[10],在成年后广泛表达于小鼠器官[8]。提示DOT1L基因的表达受某种特定信号的调节。永生小鼠内髓集合管细胞在暴露于二甲亚砜时DOT1L mRNA水平上调,但转录因子上调小鼠DOT1L转录的机制还不明确[8]。在小鼠肾集合管细胞DOT1L mRNA的水平受醛固酮抑制[11];在热带爪蟾蜕变期间,DOT1L通过T3反应元件(T3 response element,TRE)结合配体甲状腺受体激活转录[12]。

H3K79的1、2、3甲基化(H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3)水平与染色质区域、所处细胞周期及发育阶段呈动态相关[13]。组蛋白“串扰”影响H3K79甲基化水平。Dot1/DOT1L介导的H3K79的2和3甲基化依赖于H2BK120(哺乳动物)/K123(酵母)和H2BK34的单泛素化[14-18]。H3K79的2和3甲基化需要泛素化H2B和酿酒酵母Dot1富含赖氨酸区域之间的相互作用[19-20]。在泛素化依赖的H3K79的3甲基化的另一机制中,COMPASS复合体或蛋白酶体ATP酶Rpt4和Rpt6连接泛素化的H2B和H3K79[21-22]。在转录延伸时,H2BK123单泛素化需要Paf1复合体(与RNA聚合酶Ⅱ延伸相关)参与,进而引起H3K79甲基化[23],而该Paf1复合体的一些组件如Rtf1和Paf1,也与COMPASS和Dot1相互作用[23-24]。另外,DOT1L与磷酸化RNA聚合酶Ⅱ有相互作用,这可能导致了转录延伸区域周围H3K79甲基化[25]。总体而言,转录延伸复合物增强了Dot1/DOT1L介导H3K79的2和3甲基化。其他可能原因:泛素化H2B促进染色质结构改变,增加H3K79甲基化的可能性[26]。在酿酒酵母中,另一个影响H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3水平的组蛋白“串扰”机制是组蛋白H4的N-端碱性区域和Dot1酸性区域之间的相互作用[27-28]。SIR3和Dot1竞争结合组蛋白H4的碱性区域。K16乙酰化组蛋白H4抑制SIR3与H4的N-端的结合,同时促进Dot1依赖的H3K79甲基化。 此外,在人类细胞中通过过表达H4K16乙酰化酶SIRT1来降低局部H3K79me2水平,这表明沉默蛋白SIRT1和DOT1L竞争结合组蛋白H4[29]。相反,在锥虫中H3K76 2或3甲基化不需要组蛋白H4的N-端[30]。

有些基因是保持H3K79甲基化水平的关键。在酿酒酵母中,Swi4(调节亚基)和Swi6(DNA结合部分)都是转录复合物SCB-结合因子的组成部分,二者均是维持H3K79me2水平所必需的,但在维持H3K79me3水平中并不需要[31]。相比之下,ARD1(N-端乙酰基转移酶A复合物的催化亚基)在维持H2B单泛素化和H3K79me3水平中是必需的,而H3K79me2则不需要[32]。

H3K79的非甲基化形式比甲基化形式更加丰富。基于质谱结果,H3K79me1检测率比H3K79me2高,而H3K79me3在小鼠和人类中很少发现[9,33-34]。特定的去甲基化酶还未发现,甲基化H3K79向去甲基化转化的机制尚未提出。相反,不同形式H3K79甲基化修饰暗示以下几种催化过程:首先,Dot1催化1到2、2到3的甲基化需要Bre1依赖性H2BK123泛素化[35-36]。第二,在基因转录过程中H3K79me1水平降低的同时,H3K79me2水平则升高,这表明此改变有助于激活转录[37]。与此相一致的是,在异染色质形成过程中H3K79me2是降低的[38]。但是甲基化水平与表达水平并不相关,可能是因为在高度转录区域转录时发生组蛋白替换[39]。由此推测,着丝粒区H3K79me3的积累可能是由于此区域异染色质组蛋白替换缓慢所致[40-41]。第三,H3K79甲基化发生在新结合到核小体的组蛋白以及已存在的组蛋白[34-35]。H3K79甲基化受到细胞分裂过程中组蛋白稀释的影响,即复制依赖型组蛋白交换解释了H3K79甲基化的变化[38]。随着受精,H3K79甲基化的损耗独立于DNA的合成[41]。最后,在芽殖酵母中90%的H3K79发生甲基化,提示在该生物体内去甲基化酶的活性被高效的甲基化所掩蔽[38,42]。

H3K79甲基化的可逆性 虽然H3K79甲基化的形成特征明显,并受到多个过程的严格调节,但该位点主动去甲基化的过程却知之甚少。迄今,除H3K79外,其他已知的甲基化修饰的组蛋白赖氨酸残基都可以被至少一种组蛋白去甲基化酶去甲基化[2]。一系列证据表明H3K79甲基化可能是可逆的,因为它受动态调节。首先,在酵母和人类细胞中,H3K79me2水平随细胞周期而波动[7,31]。其次,在小鼠和果蝇早期胚胎发育期间H3K79me2是去甲基化的,这表明非活性去甲基化酶可能存在于成熟卵母细胞中[6,41]。再次,二羟戊二酸(2-HG)对α-酮戊二酸(α-KG,双加氧酶的辅因子)的拮抗作用表明合成2-HG和突变异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)存在使H3K79me2的整体水平升高,其中IDH是催化异柠檬酸氧化脱羧为α-KG的NADP依赖酶[43]。这些结果表明双加氧酶可能催化体内H3K79me2去甲基化,下调H3K79me2水平。因此,亟需寻找到H3K79特异性去甲基化酶。

Dot1在细胞周期调节中的作用细胞周期是单向的不可逆过程,以确保正常的细胞分裂。研究发现,H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3水平与染色质区域、所处细胞周期及发育阶段呈动态相关,表明其在细胞周期调控中发挥作用[13]。

在哺乳动物中,DOT1L甲基化H3K79被认为是在G1/S转换期调节细胞周期进程的关键因素。老年大鼠肺组织的H3K79me3水平较年轻大鼠肺组织低;因此,低甲基化H3K79可能是与衰老(细胞周期不可逆转阻滞于G0/G1期)相关的组蛋白标记[44]。然而,与老年大鼠肺组织H3K79低甲基化相反的是,H3K79me1和H3K79me2在快速老化小鼠(SAMP)的大脑中是上调的[45]。一种解释是,H3K79甲基化程度对衰老的影响取决于不同的有机体,或者H3K79甲基化水平在SAMP中升高可能是衰老模型的结果。

小鼠DOT1L也参与分化胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和红系祖细胞的细胞周期过程。虽然DOT1L缺失的ESC仍保持增殖和多能性的能力,但在体外分化中显示出严重的增殖缺陷,导致在G2/M期累积。有趣的是,DOT1L敲除的未分化和分化ESC都显示出非整倍性,而表型则是在分化时变化更明显[46]。另外,在DOT1L敲除的ESC中可以观察到细胞凋亡[9],但在敲低细胞中未见[46]。与ESC相反,在红系祖细胞中敲除DOT1L能观察到的结果是G0/G1期累积,而非G2/M期[47],这表明DOT1L对细胞周期的影响可能具有细胞特异性。

然而,在细胞周期中H3K79甲基化的变化在进化上不是保守的,H3K79甲基化调控的相关功能也不是保守的。Dot1/DOT1L介导的H3K79甲基化在细胞增殖中的作用具有物种或组织特异性。在芽殖酵母、锥虫、小鼠ESC和人癌细胞中,Dot1/DOT1L缺失或沉默会导致细胞增殖的降低,而心脏特异性DOT1L的缺失会导致心脏组织增殖。因此,Dot1/DOT1L在不同类型细胞中对增殖功能的影响还需要有针对性的进一步研究。

Dot1在发育过程中的作用研究显示mDot1广泛表达于各组织中,如肝、肾、肺、心、脑、肠及卵巢等组织,另外研究发现在两细胞阶段的胚胎,甚至在体外19.5天的受精卵中均发现mDot1的存在[8],这表明mDot1存在于不同的发育阶段,有可能在细胞生长和分化中发挥着重要作用。目前针对Dot1和H3K79甲基化的研究在多种组织及细胞中取得了巨大的进步。

Dot1在心脏功能中的作用 在mDOT1L敲除的胚胎中观察到心血管发育缺陷,提示mDOT1L可能在心脏发育中起作用[9],这与离体研究心肌生成观察到的H3K79甲基化增加能诱导心血管标志物基因表达相一致[48]。此外,在小鼠心肌中特异敲除mDOT1L可引起扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)[49],这是一种心肌疾病,临床表现为心腔扩张和收缩功能障碍。mDOT1L介导的H3K79甲基化直接调节抗肌萎缩蛋白的转录[2]。鉴于抗肌萎缩蛋白参与构成抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物(dystrophin-glycoprotein complex,DGC),而DGC参与信号转导和心脏收缩期间缓解机械应力,因此抗肌萎缩蛋白表达下调能引起DGC不稳定,进而导致肌膜损伤。抗肌萎缩蛋白基因突变是人类DCM和肌营养不良症的病因。在mDOT1L心肌特异性基因敲除小鼠中观察到的DCM现象,可通过异位表达抗肌萎缩蛋白的截断功能域得以补救[49],这表明抗肌萎缩蛋白是DOT1L介导心脏功能的主要下游靶标。与正常心脏组织相比,人类原发性DCM心脏组织中DOT1L表达水平显著下降[49],提示DOT1L失调可能是人类DCM发病的因素之一。

Dot1在红细胞生成中的作用 DOT1L敲除的胚胎在10.5天表现出严重的贫血,说明胎儿红细胞生成受到损害[47]。mDOT1L在红细胞生成中的作用可能与先前报道的H3K79甲基化在红系特异性β-珠蛋白周围富集有关[50]。为此,卵黄囊衍生的造血细胞中mDOT1L的不足能引起G0/G1细胞周期阻滞,而且在体外生长刺激物存在时使培养的红系祖细胞凋亡,但对骨髓系的生长和分化没有影响[47]。RT-qPCR和CHIP分析表明,mDOT1L通过激活GATA2发挥其在红细胞生成中的作用。DOT1L缺陷的造血细胞下调GATA2,引起髓系转录因子PU.1去阻遏,从而阻止红细胞分化[47]。

Dot1在骨关节中的作用 髋关节骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是最常见的引起疼痛和残疾的关节疾病。OA发病有多方面的原因,其中包括显著遗传倾向[51]。关节间隙宽度(joint space width,JSW)是关节内软骨厚度的参照物,因此最小JSW(mJSW)是在临床试验和流行病学中研究膝关节和髋关节骨关节炎的主要参数。通过全基因组关联研究(GWAS)分析发现染色体19p13.3上的rs12982744多态性与OA的JSW有关,而此SNP位于DOT1L基因上,提示DOT1L可能与OA发病有关[52-53]。最近发现DOT1L是肠道Wnt基因激活必不可少的特异酶,DOT1L也是果蝇体内控制高水平Wnt信号通路下游基因表达所需的酶[54]。而Wnt信号在软骨和骨形成及滑膜关节发育中起着关键作用[55]。Wnt突变在生命早期能引起发育畦性(WNT3突变)。研究发现[52],沉默DOT1L在体外可抑制软骨生成;在ADTC5细胞(软骨细胞系)中敲除DOT1L会降低软骨分化,并降低软骨生成过程中蛋白多糖和胶原含量及矿化作用,同时Wnt靶基因的表达也有明显的降低。此外,在ATDC5软骨模型系统中DOT1L与TCF和Wnt信号交互作用[52]。这些发现表明,DOT1L通过调节Wnt靶基因的转录影响软骨细胞分化,进而参与OA发病过程。这使得DOT1L成为干预髋关节骨关节炎的潜在治疗靶点,已开发小分子抑制剂并启动Ⅰ期临床试验[53]。

通过调节DOT1L的活动来控制DOT1L依赖性疾病DOT1L缺陷抑制正常细胞周期进程,因环境和物种的不同最终导致异常增殖,包括G1期停滞、有丝分裂停滞、衰老、非整倍体和细胞凋亡。 在人体敲除或沉默DOT1L能防止癌细胞扩散。DOT1L缺陷型肺癌细胞会走向衰老,这可能是一种用来消除增殖活跃癌细胞的方法[44]。DOT1L下调也能导致LS174T结肠癌细胞的死亡,但HEK293T 细胞却不会死亡[56]。混合谱系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)融合蛋白诱导的转化细胞局部会有H3K79甲基化,但没有DOT1L的情况下会发生G1期停滞或凋亡[57]。特异的DOT1L抑制剂(如EPZ004777)能使MLL融合蛋白诱导的白血病细胞发生细胞凋亡[58]。相反,致白血病融合蛋白CALM-AF10能使DOT1L从染色质解离并降低H3K79me2总体水平[33]。总之,下调DOT1L是一个潜在的癌症治疗策略,因为DOT1L的缺失能抑制癌细胞的增殖。

尽管如此,靶向DOT1L可能对正常细胞是有害的,DOT1L介导的H3K79甲基化在发育、造血和维护器官功能方面有重要作用,提示临床应用DOT1L抑制剂一定要慎重考虑。 Daigle等[58]用DOT1L抑制剂EPZ004777治疗能杀死MLL重排型白血病细胞,但对非MLL重排型白血病细胞或造血干细胞无影响。这种差异提供了MLL融合白血病有效的治疗手段,但在其他实体瘤中需对其控制细胞增殖的能力进行评估。