藻类诱变育种技术研究进展

付峰 隋正红 孙利芹 毕璐萍 丁丽君 陈奇

（1. 烟台大学海洋学院，烟台 264005；2. 中国海洋大学海洋生命学院，青岛 266003；3. 烟台大学生命学院，烟台 264005）

藻类是水生生态系统中主要的初级生产者，在整个生态系统中具有举足轻重的地位，它们在全球二氧化碳固定和环境修复中起着十分重要的作用。同时藻类与人类生活及经济发展也有着密切的关系，藻类分布广泛且具有多样性，许多藻类富含蛋白质、维生素、微量元素以及各种生物活性物质等，是人类的重要营养源，是人类发展“蓝色农业”的基础。

随着藻类养殖规模的不断扩大，种质成了决定养殖质量和产量的关键问题。应用传统的育种方法如选择育种、杂交育种等，培育出了一系列的优良品系或品种，推动了我国海藻养殖业的发展。然而传统育种具有育种周期长、性状不稳定等缺点，限制了藻类遗传育种的研究进展。藻类诱变育种技术是近些年随着生物技术发展起来的育种技术，它是指利用各种物理和化学因素诱发藻体产生遗传变异，再根据育种目标，定向选择、培育新品种，同时获得有价值的突变藻体的育种方法［1］。在自然条件下，藻类自发突变的频率很低，而人工诱变可使突变率提高千倍以上，能有效地提高育种的效率，是人工获得新种质的重要手段。藻类诱变育种技术在提高产量、改善品质、增强抗性等方面已显示出巨大潜力［2］。

诱变育种技术根据不同作用机理，主要包括物理诱变和化学诱变。物理诱变是通过不同的辐射源对植物进行电离或非电离辐射，是一种应用比较早、操作方便、诱变频率较高的诱变技术；化学诱变是利用化学诱变剂诱导植物发生突变，具有成本低、使用方便、诱变作用专一性强等特点，是一种迅速发展的育种方法。本文就这两类诱变技术的诱变机理、生物学效应以及在藻类育种中的应用情况进行了综述，并对藻类诱变育种的应用前景进行了展望，以期为藻类诱变育种研究提供参考。

1 物理诱变育种

物理诱变辐射源有紫外线、X射线、γ射线、α射线、重离子束、超声波和激光等。其中对藻类诱变效果好，应用较广泛的有紫外线、X射线、γ射线和离子束。

1.1 紫外线

紫外线是一种非电离辐射，是使用最早、沿用最久、应用最广泛的一种物理诱变剂。紫外线可引起DNA与蛋白质的交联、胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用、DNA链的断裂、形成嘧啶二聚体等，从而导致基因突变。而形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因；嘧啶二聚体不仅可以由单链上相邻的两个胸腺嘧啶之间反应后形成，也可以产生于双链相对应的两个胸腺嘧啶之间［3］。

紫外诱变因为其设备简单、操作方便，而且成本低、安全性高等特点，得到了广泛的应用，成为诱变育种的首选方法。紫外线诱变在微藻育种中应用的比较多，获得了大量具有优良性状的突变藻株，具有较好的诱变效果［4-5］。de Jaeger等［6］通过紫外线辐射斜生栅藻得到了5株缺乏淀粉的突变藻株，它们的三酰甘油（TAG）含量显著提高，其中最有前景的一株突变体的TAG含量可以达到藻体干重的49.4%。为了提高诱变效率，有的研究者采用了多次紫外辐射诱变，结合高通量的筛选方法。Lim［7］等通过5轮紫外诱变Tetraselmis suecica，结合荧光激活的细胞分选法，获得了中性脂含量明显提高（分别提高了114%和123%）的两株藻M5和M24，有望作为生物柴油制备的原料。

在大型海藻育种中也有紫外诱变研究的报道，但是由于紫外线对藻体组织的穿透能力有限，通常是用藻体的原生质体、孢子、配子或幼嫩的叶状体做为材料进行诱变［8］。付峰［9］等用紫外线辐射处理野生型龙须菜果孢子体放散刚附着的果孢子，并通过高温胁迫筛选，初步获得了2株具有耐高温、生长快速等优良性状的四分孢子体突变藻株，研究显示刚放散的果孢子对于紫外线辐射非常敏感，紫外辐射果孢子是龙须菜的一种有效的诱变育种方法。Godfroy等［10］利用紫外线辐射和EMS两种方法对水云进行诱变，利用基因组重测序，比较这两种方法引起突变的数目、类型和分布，发现紫外辐射能够引起更大量的遗传损伤，在突变个体的基因组中发现有多于400处突变，研究显示了紫外线诱变适合用于定向诱导基因组局部突变（TILLING）技术体系。

1.2 射线

射线辐射源包括X射线、γ射线、α射线或β射线等。辐射可以造成共价键断裂，引起DNA链的断裂，当修复时不能恢复到原状就会产生突变。如果射线击中染色体则可能导致断裂，再修复时会造成缺失、重复、倒位和易位等染色体畸变［3］。

藻类辐射育种早期主要以X射线为诱变源，后期γ射线、α射线和β射线等其他射线辐射应用逐渐增多。20世纪70年代培育出的海带新品种1170是经过4 000 r的X射线处理后，又经过筛选和自交获得的品系，含碘量较高，叶片较厚，适温性较高［11］。魏慧慧等［12］采用X射线对龙须菜进行辐照诱变，验证了果孢子作为诱变材料相对于龙须菜藻尖的优越性，并筛选获得了具有耐高温和低磷速生特性的龙须菜抗逆突变体。

γ射线具有很强的穿透力，是目前藻类育种中最常使用的辐射诱变源之一。Choi等［13］利用γ射线辐射栅藻，用尼罗红染色方法筛选获得了生长快速、高油脂含量的突变体，油脂含量比野生型提高了25%，随机扩增多态性DNA分析显示突变体中发生了部分遗传修饰，二维蛋白质电泳也显示，在突变体中有关油脂合成和能量代谢的一些蛋白质过表达，研究证实射线育种可以用来有效开发生物燃料微藻。Yoon等［14］利用γ射线辐射异形水绵，得到了生物量和淀粉含量提高的突变株，对其进行蛋白组学分析发现，有18个差异表达蛋白与光合、碳水化合物等代谢通路相关。

条斑紫菜和坛紫菜是我国大规模养殖的经济品种，紫菜色素含量的高低决定着商品紫菜质量的好坏，同时色素突变体对于紫菜的遗传学，生理学和育种学等方面的研究，以及对于养殖品种的改良都具重大意义［15］。因此国内外的研究者陆续开展了诱变获得紫菜人工色素突变体的研究。严兴洪等［15-16］利用60Co-γ射线分别对坛紫菜叶状体和条斑紫菜壳孢子苗进行诱变，分离获得了多种色素突变体，各色素突变品系的叶状体活体吸收光谱不仅与野生型品系有明显的差异，而且各突变品系之间也存在较大的差异。

除了色素突变体的研究，在紫菜抗逆速生新品种的诱变遗传育种方面，也取得了一定的成果。陈昌生等［17］将坛紫菜野生丝状体经一定剂量60Co-γ射线辐照后，进一步培养发现子代叶状体发生了变异，经大量培养后筛选出紫色突变体，以及在生长速度和蛋白含量等方面比对照组都有显著提高的优良个体。Zhang等［18］利用60Co-γ射线诱变条斑紫菜原生质体细胞，结合高温胁迫筛选，获得了耐高温突变株T-17，其生长速度明显高于野生型。Chen等［19］利用60Co-γ射线诱变Porphyra chauhanii野生品系叶状体，结合高温胁迫筛选，获得了生长快速的耐高温突变株 TR-5，分析显示该藻株三种主要光合色素（叶绿素a、藻红蛋白和藻蓝蛋白）的含量明显高于野生型，藻体叶片比野生型薄。

1.3 重离子束

针对传统辐射源的突变频率较低和突变随机性较大等问题，人们又发掘和利用了新的诱变因素及诱变技术，其中重离子辐射技术发展迅速。重离子束具有传能线密度（Linear energy transfer，LET）高的特点，与X 射线、γ射线、电子束等低LET方法相比，重离子束单位剂量的诱变效率要高10倍，已经在微生物及植物诱变育种中取得了巨大的经济与社会效益。重离子束辐照主要是引起DNA 链发生各种断裂及交联，进而诱发细胞突变［20］。重离子束辐射需要特殊的仪器设备，是一种新型的辐射源，在藻类诱变育种中的应用不如紫外线和γ射线广泛，但是也显示出其良好的前景。

近些年重离子束辐射在微藻育种中主要应用在产油微藻方面。王芝瑶等［21］利用碳离子束对微拟球藻进行诱变育种，最终获得两株突变藻株HP-1 和HP-2，其生长速度和油脂产率均明显高于野生型藻株。Hu等［22］利用碳离子束辐射结合叶绿素荧光方法，筛选获得了一株链带藻Desmodesmussp. S1突变株，其油脂产量比野生型高20.6%，而且重离子束对该藻的突变率可以达到28.5%，说明重离子束辐射对微藻的诱变是非常有效的。Wang等［23］利用碳离子辐照羊角月牙藻后，分离获得了5个叶绿素a缺陷的子代，分析它们的光合作用特点，发现光合效率、光保护能力和光捕获天线的表达都受到辐射的显著影响，这也是碳离子束辐射引起绿藻光合色素改变研究的首次报道，为揭示重离子束辐射诱变机制提供了研究基础。

在紫菜和海带中也有重离子束辐射诱变的研究，显示出其在大型海藻中的应用潜力。Niwa等［24］利用碳离子束辐照条斑紫菜配子体叶片，诱导获得了色素突变体，并对其中红色和绿色突变体的生长和光合色素含量与野生型进行了对比，显示重离子束诱变是一种紫菜遗传育种研究的有效方法。鲁晓萍［25］对条斑紫菜丝状体进行重离子束辐照诱变，并利用SSR分子标记分析突变体的遗传多样性，发现诱变丝状体间的遗传多样性较高，说明诱变可以有效丰富条斑紫菜的种质资源。李晓捷等［26］利用碳离子束对海带进行辐射育种，对正向变异幅度大的候选植株进行DNA变异检测，将表型性状和品质性状明显改良并且DNA结构发生明显变异的植株作为新品种选育的育种材料，研究发现通过重离子辐射可诱导海带配子体产生大量变异，能在较短的时间内获得优良变异植株，获得与优良性状相关的新基因源。

1.4 常压室温等离子体

常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）作为一种新兴的高效生物突变手段，具有放电均匀、活性粒子浓度高、化学活性物种可调控性好、操作简单、安全性高、环境友好、突变速度快、突变率高及突变多样性大等特点［27］。目前该技术已成功应用于包括微生物和微藻的突变。

等离子体的主要组分是高浓度的活性粒子，能够穿透细胞壁和细胞膜，破坏DNA分子，引起突变，从而改变目标生物的代谢途径［27］。曹旭鹏等［28］利用ARTP技术对湛江等鞭金藻进行诱变，建立一整套诱变株筛选方法，获得了4株耐高光或高温的藻株，常规培养条件下7株高生长速率和5株高油脂含量的藻株。吴晓英等［29］通过等离子体诱变雨生红球藻筛，成功筛选获得一株生产性能稳定的高产虾青素藻株M45，该突变株生长速率和生物量分别较出发株提高了8.57%和6.45%，虾青素含量较出发株提高了51.96%。Fang等［30］利用ARTP技术对钝顶螺旋藻进行诱变，获得3株有代表性的诱变株，有效地提高了生长速率或多糖含量，也证明了ARTP技术对于多细胞微藻是一种有效的诱变技术。

2 化学诱变育种

目前烷化剂是藻类诱变育种中最有效和应用最多的化学诱变剂。这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反应，从而改变DNA分子结构，引起突变［3］。相对于物理诱变，化学诱变对处理材料引起的生物损伤小，诱发染色体畸变的比率相对较小，诱发位点具有特异性，诱发突变多是基因的点突变［31］。应用比较多的化合物是甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulphonate，EMS）和N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N’-Nitronitrosoguanidine，MNNG）等。

近些年EMS和 MNNG诱变在微藻中应用广泛，主要利用其诱导产生代谢产物过表达的突变体，如虾青素、类胡萝卜素和二十碳五烯酸（EPA）［32］等。Ong等［33］利用EMS诱变小球藻获得了两株耐热突变体，在高温（40℃）培养时的生长速度比野生型快3.3-6.7倍，固碳速率明显高于野生型。Perin等［34］利用EMS和插入突变技术对微拟球藻Nannochloropsis gaditana进行了随机诱变，筛选获得了光利用效率和产量明显提高的藻株，显示了诱变导致的遗传改变具有产生高产量微拟球藻的潜能。Shirnalli等［35］利用MNNG诱变，获得了2株高生物量、高藻蓝蛋白和蛋白质含量的钝顶螺旋藻突变株。Sandesh等［36］利用紫外线、EMS和MNNG对雨生红球藻进行诱变，并利用除草剂草铵膦进行突变株的筛选，获得的突变株总类胡萝卜素和虾青素含量提高了23%-59%，从转录水平上分析发现类胡萝卜素合成途径相关基因的表达均明显高于野生型，其中紫外诱变获得的突变体的番茄红素环化酶活性最高，其次是MNNG诱变的突变体，研究揭示了诱变可以改变野生型藻体的生化特征，主要是由于其分子水平上的改变。

MNNG对于龙须菜来说是一种高效诱变剂。张学成等［37］利用MNNG诱变处理龙须菜藻体，通过羟脯氨酸及高温（35℃）筛选，获得了龙须菜良种981，近些年又用同样的方法，对981龙须菜进行了进一步的遗传改良。研究发现紫菜比江蓠等海藻更难被一般的化学诱变剂所诱变。经过国内外学者数年来的努力，在紫菜色素突变体的诱导和分离中取得了一定的成果，MNNG被证明是最有效的化学诱变剂。利用MNNG对条斑紫菜、坛紫菜等紫菜属种类的生活史中各阶段的藻体，如丝状体［38］、壳孢子［39］、叶状体［40］等进行诱变处理，成功地得到了大量的色素突变体，并分析了诱变获得的突变体的色素组成和变化特征。

3 展望

大量实践证明，诱变技术在创造新种质，培育植物新品种，提高种质资源多样性等方面具有独特的作用。高等植物中诱变技术育种已取得了举世瞩目的成就，育成品种的数量、种植面积和取得的经济、社会效益均居世界各国首位［41］。藻类诱变育种工作起步较晚，目前研究主要集中在雨生红球藻、小球藻、钝顶螺旋藻等生物活性物质含量较高的微藻，以及一些生物能源微藻中，旨在提高藻体的代谢物质含量和产量，取得了不俗的成绩，筛选获得了大量的具有优良性状的变异藻株。近些年诱变技术也逐渐应用到一些大型经济海藻的色素突变体和优良品种的遗传选育方面。传统的物理和化学诱变技术，结合目前新的诱变源如离子束、常压室温等离子体等诱变技术，正越来越多地应用到藻类育种中，在藻类种质改良和遗传学研究中起到重要的作用。

在诱变育种中，突变是随机的，能够产生大量的突变体，筛选具有目标性状的突变体是费时费力的，因此建立高通量的突变体筛选方法，将有利于获得有益变异的藻株。传统的形态学特征和生理生化分析的方法已经很难满足现代藻类种质鉴定和新品种选育的要求。分子标记技术的出现为这一问题的解决带来了契机，利用分子标记技术对突变体进行分析、鉴定筛选，可以有效提高选择效率［42］。将生化分析、物理学分析以及分子标记辅助等筛选方法有效结合，逐步建立目标突变体的定向筛选技术，这也是今后藻类诱变育种研究的重要内容。

与常规育种方法相比，藻类诱变育种是一种高效的育种手段，具有操作简单、效率高等优点，可以在短时间内带来丰富的遗传变异。但诱变育种也存在一些不足，如诱变的频率和幅度还不够高、诱变的方向具有不确定性、诱变的效果不理想。要解决这一问题，就必须根据藻类的生物学特性，借鉴高等植物成熟的诱变育种体系，选用合适的诱变方法，选择适宜的诱变材料，扩大诱变群体，建立高效的筛选技术，获得优良的新种质。随着现代生物技术的发展，充分利用分子遗传学和基因工程相关技术，在分子水平上揭示突变的发生机理，使定向诱变成为可能，实现藻类育种的高效发展。