抗草甘膦水稻突变体osgr-1 EPSPS基因克隆及生物信息学分析

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(1.贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，　贵阳 550025；2.贵州省农业科学院，　贵阳 550006；　3.贵州农业职业学院，　贵州 清镇 550014)

草甘膦是一种高效、广谱、低毒、低残留、内吸传导的灭杀性除草剂[10,13]。草甘膦作为植物体内莽草酸生物合成途径中的竞争性抑制物，可优先与磷酸稀醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid，PEP)和莽草酸-3-磷酸(Shikimic acid-3-phosphoric acid，S 3 P)结合，阻断芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)的合成。此过程中的关键酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)活性受抑，蛋白质合成就会受到干扰，阻止次生产物形成，最终引起植株失绿而死亡[1,11,15,18,23]。研究发现，自然界生物中存在对除草剂草甘膦产生抗性的多种基因，主要有aroA基因、cp4-EPSPS、G6等，其中cp4-EPSPS基因已广泛应用[22]。研究发现，EPSPS基因对草甘膦产生抗性主要是由于该基因序列碱基发生突变。目前，已报道的有从鼠伤寒沙门杆菌(Salmonellatyphimurium)中获的抗草甘膦突变株，EPSPS基因的第101位碱基发生突变，由脯氨酸(Proline)突变成丝氨酸(Serine)，后来在矮牵牛进行EPSPS基因定点突变，也获得产生抗性的植株[21]。Stalker等在Klebsiellapneumoniae和Escherichiacoli中也发现相类似的单碱基突变引起的草甘膦抗性突变株，第96位碱基发生突变，导致甘氨酸(Glyine)突变成丙氨酸(Alaine)，对草甘膦产生比野生型高达800倍的抗性[25-26]。何鸣等发现第42位碱基发生突变也会引起植物对草甘膦产生抗性[8]。因此，从突变体库中筛选和挖掘新的草甘膦抗性基因、对创制和培育抗草甘膦新种质具有重要意义。

本研究以化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethylmethan sulphonate，EMS)处理获得的贵州地方稻种黎平杂边禾突变体群体为材料[20]。经除草剂草甘膦喷施处理筛选得到抗性突变株，通过同源克隆、基因测序及序列分析、功能预测，分析该突变水稻植株中EPSPS基因碱基突变引起的结构改变，并预测突变基因编码产物功能的改变，为挖掘新的草甘膦抗性基因和培育草甘膦抗性水稻新种质提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　材　料

抗草甘膦水稻材料由贵州大学农业生物工程研究院利用EMS诱变贵州地方稻种黎平杂边禾筛选获得并保存，该水稻突变体命名为osgr-1。RNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司；TaKaRa反转录试剂盒、5 000 bp、2 000 bp ladder DNA marker，LA Taq tm with GC Buffer购自TaKaRa公司；RNase-Free ddH2O购自北京天根生化科技公司，IPTG及X-Gal购自Amersco公司；Trans-5α感受态细胞购自OMEGA公司，扩增引物合成和回收产物测序由上海英捷生物科技有限公司完成[7,14]。

1.2　突变体EPSPS基因的克隆

1.2.1引物设计

根据NCBI数据库查询获得EPSPS基因cds序列，GenBank：AF 413082.1，利用Primer 5.0在线软件设计特异性引物，设计扩增引物为：上游30 bp：OsEPSP-F 5-CCCAAGCTTGGGATGGCGTCCAACGCCGCG-3’，下游28 bp：OsEPSP-R 5’-GGAATTCCTCAGTTCCTGACGAAAGTGC-3’[14]。

1.2.2PCR扩增

实验材料选取黎平杂边禾与突变体osgr-1嫩叶片，提取叶片中RNA，总PCR反应液25μL：上下游引物各0.5μL,cDNA:1.0μL,TaKaRa LATaq(5 U/μL):0.25μL,GC Buffer Ι∶12.5μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L):4.0μL,RNase-Free ddH2O:6.25μL。PCR反应体系：94 ℃ 3 min(94 ℃ 30 s，60～55 ℃ 30 s)72 ℃ 3.5 min)5 cycles;(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 3.5 min,30 cycles)72 ℃ 7 min,4 ℃ forever,35 cycles。

1.2.3目的片段TA克隆与鉴定

1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，与p MD 18-T克隆载体在4 ℃条件下过夜连接，连接产物转化至50μL Trans-5α感受态细胞，转化后加900μL LB培养液摇匀复苏1 h，将复苏后的菌液涂布于含0.1 mg/mL Amp、0.5%IPTG及0.04 mg/mL X-gal的LB平板培养皿表面，37 ℃避光培养12 h；挑取白色阳性单克隆菌落，用LB(Amp+)培养液37 ℃扩大培养，之后进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系为20μL：菌液0.8μL，上下游引物各0.4μL，2×PowerTaqPCR Master Mix 11μL，水7.4μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性菌液送上海英捷生物科技有限公司进行测序[3,9]。

注：Upper line:osgr-1；Lower line:WT cds。　图3　osgr-1与野生型EPSPS基因序列比对

通过对其编码的蛋白分析可知蛋白等电点为8.33，在氨基酸第405位疏水性达到高峰，最大值为2.622；在第380～381位亲水性达到高峰，值均为-2.656；不稳定系数为33.40；脂溶指数为93.95，总平均疏水指数为0.104(图6)，说明该蛋白为疏水性蛋白。

做法：1.先制起酥面团。先用265 g面粉加凉水、柠檬酸、鸡蛋液、盐和面，揉制15～20 min。将面团放在撒了面粉的面案上饧放 20～30 min。再将人造奶油切成小块，撒上面粉，搅拌成油面混合物，放案上切成扁平方块，放冰箱中冷却至12～14℃。将饧好的面团擀压成正方形大片，中间稍厚，四边擀薄些。将冷却好的人造奶油块（约130 g），放在方面片中央，从两侧折起包合在一起。然后再把面团重新擀平；叠 4层，再擀平；再叠为 4层，放冷箱内，冷藏 30～40 min；从冰箱取出后，再次擀平，仍叠为4层，入冰箱冷却。第二次从冰箱取出后，要再次叠为4层，第三次入冰箱冷却，即成为起酥面团。

1.3　EPSPS基因生物信息学分析

1.3.1主要分析软件

生物信息学主要分析软件有：DNAMAN、EditSeq、MegAlign、Potscal、TMPRED、SignalP、Psort、SOPMA及SWISS-MODE等[12,16-17]。

1.3.2EPSPS基因序列分析与结构预测

将克隆的水稻突变体中EPSPS基因序列，用DNAStar序列分析软件中EditSeq软件查找其开放阅读框，DNAMan对所获得序列进行比对；利用DNAStar中MegAlign序列比对软件对其相似性进行分析；用Potscal序列分析氨基酸的疏水性；通过在线软件TMPRED分析其跨膜结构；用SignalP预测蛋白质信号肽；用Psort软件来对其蛋白进行亚细胞定位；运用SMART对蛋白的结构域进行分析；使用SOPMA在线预测软件对蛋白质的二级结构进行预测；利用SWISS-MODEL对EPSPS三级结构同源建模，Swiss-PdbViewer对所研究突变体的EPSPS三级结构进行分析[6,16,24]。

2　结果与分析

2.1　总RNA检测

抗草甘膦水稻突变体osgr-1的基因总RNA用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测到带型完整的2条带(图1)；测定的A260/A280比值在1.8～2.0之间，表明RNA完整性较好，无蛋白质和DNA污染，测得浓度为1 516 ng/μL，适合进一步反转录为cDNA。

2.2　反转录为cDNA测序

用TaKaRa反转录试剂盒将所有产物反转录为cDNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测到带型完整的条带(图2)；将回收的产物送往上海英捷生物科技有限公司进行测序。

图8为3号试样在1500 ℃空气中焙烧86 h后涂层表面XRD物相分析结果．从图8可见，3号试样焙烧后的表面涂层主要由碳化硅(Silicon Carbide，PDF42-1091)、莫来石(Mullite，PDF1-613)和二氧化硅(Silicon Oxide，PDF14-260)组成．

2.3　抗草甘膦水稻突变体osgr-1的EPSPS基因碱基突变分析

2.3.1野生型与突变体osgr-1的EPSPS碱基序列比对

通过测序比对(图3)可知，突变体osgr-1的EPSPS基因cds序列中第226位碱基C变为G；第301位碱基G变为T，第311位碱基A变为C。

图1　突变体osgr-1总RNA琼脂糖凝胶电泳

图2　反转录EPSPS基因琼脂糖凝胶电泳

2.3.2蛋白质序列比对

由图4比对，突变体osgr-1的EPSPS基因编码的蛋白质中，第76位的脯氨酸变成丙氨酸；第101位的丙氨酸变为丝氨酸，第104位的谷氨酸变为丙氨酸。

2.4　EPSPS基因分析

认定关联性企业的最终目的是为了准确定罪和量刑，不枉不纵。为了正确地、合理合法地分割和处理关联性企业的相关财产，准确把握政策界限。近年来，立法机关和司法机关不断通过立法解释、司法解释、会议纪要等规范性法律文件或审判参考对黑社会性质组织的“经济特征”进行细化，但由于法律规定无法穷尽社会生活中所有关联性企业的财产样态，以致在实务中组织性质的认定问题上仍存在模糊且不无矛盾。因此，归纳当前司法实践的认定标准就具有重要的现实意义，以正确判断涉案的相关组织是否构成黑社会性质组织、关联性企业，进而明确罪与非罪的界限。

注：Upper line: osgr-1的EPSPS基因蛋白质序列；Lower line: WT的EPSPS基因蛋白质序列　图4　osgr-1与野生型EPSPS基因编码的蛋白质氨基酸比对

图5　osgr-1 突变体的EPSPS基因蛋白信号肽分析

图6　水稻osgr-1 的EPSPS蛋白疏水性分析

采空区充填后形成含水介质为中粗砂的含水层，围岩具有隔水作用。地下水的主要补给来源为大气降水，渗入地下部分沿基岩构造裂隙发育方向，汇集到中粗砂中，其排泄方式主要为人工开采。经估算，采空区蓄置的含水层，调节资源量约为1.3万m3，单井涌水量大于1000m3/d，成为花岗岩基岩裂隙水贫水区中的富水地段。

2.4.2蛋白质信号肽分析

利用SignalIP软件对osgr-1突变体进行蛋白信号肽的预测，分析结果发现，C-score值为0.158，Y-score值为0.187，S-score值为0.515，SP=‘NO’，D-score值为0.204，各值含量较低，说明该蛋白不存在信号肽(图5)。

2.4.3蛋白质理化性质分析

2.4.1氨基酸序列分析

2.4.4蛋白质跨膜区域分析

[4]段明.谷子EPSPS基因的分离、修饰及表达载体的构建[J].江苏农业科学,2016,44(5):51-56.

阮亭云： 屡于《盘山志》搜得未收诗文，奉寄可称快事。 ……《山志》序草成一稿，请正。 愧不能工……甘心受劳受苦，绝不退悔。[3]136

2.4.5蛋白质二级及三级结构预测

利用PSIPRED在线分析osgr-1的EPSPS基因编码蛋白的分析结果表明，目的蛋白二级结构包含14个α螺旋(α-helix)、25个β折叠(β-strand)，有40个无规则卷曲(random coil)将α螺旋与β折叠连接(图9)。利用SWISS-MODEL对WTEPSPS基因编码蛋白、osgr-1EPSPS基因编码蛋白三级结构同源建模(图8)，osgr-1的EPSPS编码蛋白氨基酸存在不同程度的差异，但三级结构出现明显差异。三级结构呈单聚体，由2个亚基组成，有4个氯离子、3个镁离子、1个磷酸根离子的结合位点和2个结构域。结构中可以看到4个折叠区，其中每个单体有由6个β螺旋组成的折叠区和4个β折叠区组成。

图7　osgr-1 EPSPS基因蛋白跨膜分析

3　讨　论

生物信息学已被广泛应用于病毒研究、基因信息分析、疾病机制的探索等多个生物学领域，已经逐渐成为蛋白质结构与功能预测的重要工具[4]。目前，多参数多方法的综合性预测提高了其对蛋白质结构和功能预测的准确性[12,27]。EPSPS不仅是一种可促进植物、微生物中的芳香族氨基酸及其它的一些必需的衍生物的生物合成的合成酶，同时也是除草剂草甘膦的作用靶标[5,14]。因此，对EPSPS编码基因的结构及其功能的生物信息学分析与预测，有利于了解草甘膦与EPSPS蛋白的互作模式，对筛选和培育草甘膦抗性作物新种质提供理论基础。

培育杨树大苗的苗期管理工作包括中耕除草、灌水、追肥、防治病虫害和整形修剪等。移植后适时灌水是提高成活率的关键。生长期内结合灌水及时进行中耕和追肥，同时要注意及时发现和防治苗木病虫害，对于杨树大苗，整形修剪是苗期管理的关键，特别是截干移植的木。整形修剪的技术有以下几种：

图8　osgr-1的EPSPS蛋白三级结构分析

本研究利用生物信息学方法对抗草甘膦水稻突变体osgr-1的EPSPS基因进行分析，发现突变体osgr-1的EPSPS基因氨基酸序列发生了3个点突变，从而分别导致其编码的脯氨酸变成丙氨酸、丙氨酸变成丝氨酸和谷氨酸变为丙氨酸，这与NCBI报道的由脯氨酸变为丝氨酸、甘氨酸变为丙氨酸以及苏氨酸变为甲硫氨酸不同，表明EPSPS基因中其它的位点的突变也能引起突变株对草甘膦的抗性。

目前，已从细菌、藻类、植物中分离到EPSPS基因并应用于生产[25]。对农杆菌、大肠杆菌、分枝杆菌、肺炎链球菌中EPSPS的晶体结构分析发现，它们均包括2个相似的结构域，每个结构域由3个亚单位组成，3个亚单位由4个β折叠、2个α螺旋组成[4]，大多数蛋白质在形成成熟蛋白质的过程中需要经过适当的修饰。蛋白磷酸化被认为是自然界中最重要的翻译后修饰方式，参与信号转导、基因表达、蛋白质合成、细胞周期等生命活动[6]。经生物信息学分析，抗草甘膦水稻突变体osgr-1的EPSPS基因共编码511个氨基酸，其编码蛋白等电点为8.33，在氨基酸第405位疏水性达到高峰，最大值为2.622；在第380～381位亲水性达到高峰，值均为-2.656；不稳定系数为33.40；脂溶指数为93.95，总平均疏水指数为0.104，说明该蛋白为疏水性蛋白。

图9　osgr-1 EPSPS基因蛋白二级结构分析

程华等利用RACE技术，克隆到银杏(GinkgobilobaL.)EPSPS合酶基因(GbEPSPS)的cDNA序列并对其进行生物信息学分析。得出银杏EPSPS蛋白质序列与其他物种的EPSPS同源性较高。在银杏的叶和果实中EPSPS基因表达量最高、茎次之、根最低[2]。巩元勇等在克隆棉花EPSPS基因的过程中，发现了该基因的一条可变剪接序列。分析发现，该序列比正常的EPSPS基因的cDNA序列少152 bp，这造成了终止密码子在该序列的提前出现；EPSPS基因内含子的剪切是按照“AT-AC”规则，该可变剪接序列预测的三维结构模型同正常的EPSPS基因的三维结构存在显著差异[5-6]。程海刚等利用点突变技术对所获EPSPS基因进行定点(E 515 Q)突变，采用RACE技术克隆、拼结出了青麻EPSPS基因的全长cDNA序列，发现EPSP合成酶有较高的保守性，与欧洲山毛榉(Fagussylvatica)、水稻(Oryzasativa)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、菜豆(Phaseolusvulgaris)的EPSPS同源性较高[1,3,19]。Yu等[27]研究发现，具有草甘膦抗性的牛筋草(Eleusineindica)，抗性来源于其体内EPSPS的苏氨酸突变为异亮氨酸，脯氨酸突变为丝氨酸。EPSPS是草甘膦作用于植物产生抑制的关键性合成酶。EPSPS基因存在于细胞核中，但是其成熟的蛋白则存在于叶绿体中[15]。为了提高植物对草甘膦的耐受性，大多数的研究是致力于对EPSPS的分析。

对抗草甘膦水稻突变体osgr-1的EPSPS基因做了详细的生物信息学功能预测分析，但对突变体osgr-1的抗性机理、突变EPSPS基因功能还需要进一步研究。

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对编码的蛋白质氨基酸序列进行分析发现，osgr-1突变体的EPSPS基因共编码全有511个氨基酸，分子量为53,823 kDa，带电荷氨基酸118个，占25.97%；酸性氨基酸54个，占11.46%；碱性氨基酸62个，占14.11%；极性氨基酸108个，占20.14%；疏水性氨基酸204个，占34.94%。氨基酸含量较多的是：丙氨酸(Ala，13.50%)，缬氨酸(Val，10.37%)，亮氨酸(Leu，8.81%)，甘氨酸(Gly，8.61%)，丝氨酸(Ser，7.24%)(图4)。

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通过对蛋白质跨膜区域进行分析发现，osgr-1的EPSPS基因编码蛋白存在4个跨膜螺旋(图7)，分别在N端的氨基酸167～189位、240～3260位、323～339位、399～416位，跨膜方向分别是O-I-O-I。

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据最新统计显示，我国耕地面积为20.27亿亩，平均每年减少500万-600万亩。“如何用越来越少的土地、越来越少的水资源、越来越少并越来越贵的劳动力生产出更多、更好、更安全的农产品，是我国农业接下来面临的挑战。”柯炳生指出，未来中国农业的发展必须突破肥料制造技术、土壤技术与保护技术的瓶颈，土壤修护与有机质提升需要政府强力推动，更需要龙头企业积极参与。瑞丰生态在基层土壤修护方面走在同行前列，并做了大量有益工作，取得了明显成效，需要认真总结经验，进一步加大对推广模式与基层土壤修护服务体系、工作站的宣传推广，不断扩大推广区域，在全国起引领作用。

汉语对外来词的吸收改造功能则远不如日语，其对外来语的态度是一个至关重要的因素。与日本对外来文化的“拿来主义”不同，汉民族对外来文化本来就抱有一种警惕和排斥的心理。因此在外来词的吸收过程中，也总是力图与其划清界限，尽可能避免直接使用外来词或对其进行任何形式的改造，而是更多地采取意译。

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鼻科医师应该认真对待每一次医学模型中的解剖训练。在模拟标本操作前，鼻科医师应当首先熟练掌握鼻腔鼻窦、鼻颅底、鼻眶相关解剖的理论知识，并仔细阅读鼻鼻窦CT，了解鼻腔鼻窦解剖异常情况，需要充分熟悉鼻内镜鼻窦手术相关的器械特点和性能。具体操作过程中，必须注意规范化鼻内镜技术操作，明确掌握技术要点。我们推荐的鼻内镜鼻窦手术规范化操作步骤如下。

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2）安装队伍进场拆除原2台射水泵→NASH水环式真空泵运输就位并固定基础→真空泵进汽/排空气管道→冷却水进水/排水管道的测量预制焊接→管道防腐→电气接线→仪表更改真空泵DCS启、停画面及逻辑程序→一次性调试成功，耗时32h，参与技术工数量7人。

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我们的先祖凭借超然的修养与执着的信念，留下了无数精美的木雕作品给我们，形成丰富的样式、风格和活力，为我们的精神世界增添了缤纷的情思。早在秦汉时期，中国木雕就凸显出熟练的技艺水平与细腻的创意，那些深藏于各种汉墓中的文物，无论人物还是动物，无一不显现出先人对生命气息、美学理念的孜孜不倦的探寻。每个单一的个体，放在群组之中，其“性情”依然鲜活，而从整体的角度看，它们又能恰当地表述特定历史时期的讯息。

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