东湖表层沉积物中氨氧化古菌和氨氧化细菌丰度及多样性研究

潘彦羽　代嫣然　王飞华　梁　威

(1. 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

随着人口的增长以及经济的快速发展, 大量氮磷等营养元素及有机污染物未经处理即汇入淡水生态系统[1], 致使其生态系统的生态服务功能日渐退化甚至消失。2015年《中国环境统计年报》显示全国废水中氨氮排放量2.3×109kg, 其中城镇生活污水中氨氮排放量占氨氮排放总量的58.3%, 农业源氨氮排放量占排放总量的31.6%, 工业废水氨氮排放量占氨氮排放总量的9.4%[2]。水体中氮素含量过高不仅会极大促进藻类的生长繁殖, 导致水体富营养化, 还会毒害其中的水生动物[3,4]。

氮循环具有复杂的变化过程, 并且与微生物多样性和群落结构密切相关。这个过程包括： 固氮作用、氨化作用、硝化作用和反硝化作用[5]。其中氨氧化是硝化作用的第一步, 也是限速步骤[6]。长期以来, 氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacterial,AOB) 被认为是氨氧化作用的主要承担者[7], 然而,近年来随着分子生物学技术的发展和研究的深入,新一类具有氨氧化能力的微生物——氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea, AOA) 从环境中被分离和鉴定出来。2005年Konneke等[8]从海洋沉积物中分离了一株氨氧化古菌。2006年Leininger等[9]在欧洲中性土壤中发现了AOA的广泛存在, 并且amoA基因丰度大于AOB。氨氧化过程中两个关键酶分别是氨单加氧酶和羟胺氧化还原酶。氨单加氧酶是由amoA、amoB、amoC三个基因编码的α、β、γ三个亚基组成。目前, 编码α亚基的amoA基因被广泛用于生态系统中AOA和AOB的研究[10]。大量研究表明, AOA和AOB存在于很多生态系统中,如土壤[11]、海洋沉积物[12]、湖泊沉积物[13]和活性污泥[14]等, 但是AOA和AOB在淡水生态系统尤其是沉积物中的生态特征、功能差异及多样化环境要素的影响机制仍需要进一步研究[15]。

本研究以典型城市湖泊——东湖为例, 通过监测东湖表层沉积物的理化参数, 采用荧光定量PCR和高通量测序等分子生物学技术, 以功能基因amoA为分子标记, 对AOA和AOB进行定量和定性分析。探讨在不同环境条件下表层沉积物中AOA和AOB的amoA基因的数量及多样性, 分析底质和水质中各种理化因子对它的影响, 力求为湖泊氮循环研究提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　采样地点

本研究选取东湖子湖——郭郑湖作为研究对象, 设置3个采样点(图 1), 1号点(30°33′4.71″N 114°21′36.68″E); 2号点(30°33′49.02″N 114°23′3.52″E);3号点(30°33′6.20″N 114°23′31.73″E)。

1.2　样品采集

分别于2016年1月、4月、7月和10月采集东湖表层沉积物样品(12个样品, 0—20 cm)。将沉积物样品充分混匀后分两份置于无菌塑料袋中密封,4℃保存运回实验室, 一份自然风干过200目筛用于理化性质的测定, 另一份放于-20℃冰冻保存用于后续分子实验。

1.3　理化指标测定

采用标准方法对样品进行分析, 其中pH采用pH计(Mettler Toledo, Switzerland)测定; 氨氮(-N)、亚硝酸氮(-N)、硝酸盐氮(-N)采用氯化钾溶液提取-分光光度法测定; 底泥总氮(TN)、总磷(TP)测定按照《土壤农化分析》(第三版)所述方法进行[16]; 总有机碳(TOC)采用总有机碳分析仪(Elementar, Germany)测定。每个样品设置3个平行。

1.4　沉积物中AOA和AOB丰度的测定

沉积物样品DNA提取称取0.3 g沉积物样品, 采用PowerSoil DNA试剂盒(MO BIO Laboratories Inc., USA)进行样品DNA提取, 提取产物用1%的琼脂凝胶电泳检测。

图 1　东湖采样点Fig. 1　Sampling sites in Donghu Lake

绝对定量标准曲线制作参照He等[17]报道的方法, 将提取的土壤样品的微生物全基因组DNA混合并作为PCR扩增的模板, 扩增引物和程序如表 1所示。扩增体系为： 10×PCR buffer (Mg2+)5 μL, dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL, 正反向引物(10 mmol/L)各1 μL, Taq酶(2.5U)0.25 μL, DNA模板2 μL, 加ddH2O补足至50 μL。使用Easy Pure QuickGel Extraction Kit (Trans)纯化试剂盒对PCR扩增产物进行切胶纯化, T载体与PCR回收产物连接后转入JM109感受态细胞, 进行蓝白斑筛选。选取白色克隆, 采用菌落PCR鉴定阳性克隆, 所用引物为载体通用引物M13F和M13R。将挑取出的重组质粒进行测序。测序结果经NCBI比对, AOA与泉古菌(JQ345886.1) amoA基因的同源性高达99%, AOB与亚硝化单胞菌(KC769053.1) amoA基因的同源性高达99%。因此, 可作为绝对荧光定量PCR分析的标准DNA。使用EasyPure Plasmid Miniprep Kit(Trans)提取重组质粒DNA, 经核酸定量仪(Nanodrop 2000, USA) 测定浓度, AOA的amoA基因重组质粒浓度为44.6 ng/μL, AOB的amoA基因重组质粒浓度为37.5 ng/μL。根据阿伏伽德罗常数计算出amoA基因的拷贝数, AOA为2.11×1010copies/μL,AOB为1.77×1010copies/μL。将AOA重组质粒按10倍梯度稀释, 用于标准曲线绘制。

荧光定量PCR采用SYBR Green法进行荧光定量PCR, 所用引物参见表 1, 扩增体系为20 μL,其中, 2×Trans Start Tip Green qPCRSuperMix 10 μL,浓度为10 μmol/L的AOA、AOB正反向引物各0.4 μL,DNA模板1 μL, 用ddH2O补足至20 μL。采用Roche LightCycler® 480扩增仪进行定量, 其反应程序如表 1所示。实验设置阴性对照, 并与稀释好的6个标准样品进行定量扩增, 得到标准曲线, 每个样品设置3次重复。以基线(背景)荧光信号标准差的10倍作为阈值, 扩增效率＞80%, 溶解曲线为单一峰。

1.5　沉积物中AOA和AOB群落结构分析

HiSeq平台高通量测序针对氨氧化微生物的功能基因amoA, 采用表 1中的引物进行扩增。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 引物扩增出来的AOA amoA基因片段长度在600—700 bp, AOB amoA基因片段长度在400—500 bp, 使用AxyPrep-DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物, TrisHCl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果, 将PCR产物用QuantiFluoruantTM蓝色荧光定量系统进行检测定量, 之后按照每个样本的测序量要求, 进行相应比例的混合。通过Hiseq 2500平台(IlluminaSanDiego, USA)进行测序, 测序长度250 bp(凌恩生物, 上海)。

表 1　氨氧化微生物amoA基因PCR扩增引物及反应条件Tab. 1　Primers and PCR reaction conditions for amoA gene

AOA和AOB amoA基因多样性分析利用Cluster及Mothur软件对序列进行降噪, 并进行聚类,获得不同序列之间的距离矩阵, 转化为相似度, 将相似度超过80%的序列归为一个操作分类单元(Operational taxonomic unit, OTU)。通过稀释曲线比较不同样品细菌群落多样性差异。用Mothur计算微生物群落的多样性和丰度指数, 包括Shannon指数、Simpson指数、ACE指数、Chao指数和文库覆盖率C[18]。

1.6　系统发育分析

挑选丰度最高的前40个OTUs的代表核酸序列与数据库中已知序列进行比对。采用Neighbor-Joining建树方法利用MEGA6.0软件构建AOA和AOB的amoA基因系统发育树, 建树结果进行1000次Bootstrap检验。

1.7　数据分析

用SPSS 16.0统计分析软件进行方差分析及多因素相关分析。amoA基因丰度进行了以10为底的对数转换。氨氧化微生物群落结构与环境因子之间的关系采用Canoco软件进行典范对应分析, 确定显著影响AOA或AOB群落结构的环境因子, 显著水平设置为P＜0.05和极其显著P＜0.01。

2　结果

2.1　沉积物理化指标

东湖沉积物基本理化特征如表 2所示。温度随季节变化明显, 其中夏季最高(28.6—29.3℃), 冬季温度最低(6.91—7.14℃)。沉积物呈弱碱性(7.0—7.5), 1号位至3号位点, 沉积物pH呈现逐渐降低的趋势。沉积物TN含量介于1.18—2.31 g/kg (干重), 其中冬季、夏季总氮含量较低, 春季、秋季TN含量较高。沉积物总磷含量介于0.58—1.15 g/kg(干重); 沉积物-N浓度介于26.8—60.9 mg/kg(干重);-N (-N+-N)浓度介于11.1—50.4 mg/kg (干重)。TOC浓度介于27.1—49.2 g/kg(干重), 其中2号点TP、-N及TOC含量均较高,表明2号位点污染最为严重, 可能是由于2013年对1号点区域进行了清淤使得1号点受污染程度有所好转。

2.2　沉积物氨氧化微生物的丰度

AOA和AOB的定量分析结果显示(图 2), 所有样品中均检测到AOA和AOB的存在, 且AOA的丰度高于AOB, AOA与AOB的比值介于1.10—-73.6。AOA的丰度介于1.50×108—8.48×109拷贝/g沉积物(干重), 其中冬季AOA较多, 介于2.83×109—8.48×109拷贝/g沉积物(干重); 夏季最低为1.74×108—1.95×109拷贝/g沉积物(干重)。AOB的丰度介于4.87×107—2.40×109拷贝/g沉积物(干重),4个季节AOB丰度差异不显著。

表 2　沉积物理化性质Tab. 2　Physical and chemical properties in sediments

将东湖AOA和AOB的amoA基因丰度与沉积物的理化因子做Pearson相关性分析(表 3), 结果表明AOA的丰度与温度呈显著负相关(P＜0.05), 沉积物温度越高, AOA的丰度越少; AOB丰度与理化因子相关性不显著(P＞0.05)。

2.3　沉积物氨氧化微生物多样性

对Shannon指数、Simpson指数、OTU数目的Chao指数和ACE指数进行了分析, 具体结果见表4—6。利用Mothur进行数据的过滤分析, 12个沉积物样品中共得到高质量的AOA amoA基因序列906010条, 平均每个样品的序列条数为37750条。在所有的12个沉积物样品中, 按照80%的序列相似度进行OTU划分。东湖沉积物样品的OTU数量介于5—16, Shannon指数介于0.03—0.05。比较东湖不同季节不同采样的多样性指数发现, 冬季样品多样性高于其他季节, 2号位点多样性最低。

图 2　沉积物中AOA和AOB的丰度Fig. 2　The abundance of AOA and AOB in sediments

表 3　AOA和AOB丰度与沉积物理化指标相关性分析Tab. 3　Correlation analysis between the abundance of AOA and AOB and physical and chemical indicators in sediments

同时, 我们对沉积物AOB amoA基因进行测序(表 5), AOB的文库覆盖率均达到了较高的水平(＞99.9%), 这表明了所建立的amoA基因的文库涵盖了沉积物中几乎所有的amoA基因类型。不同采样点的样品OTU数量差异显著, 沉积物样品AOB的OTU数量介于42—102。Shannon指数最高的是DSP1(1.99), 最低的是DAU2(1.34)。利用不同的指数来估算样本中微生物多样性时, 各指数反应的结果略有偏差, 本研究中DSP3 Chao指数最高, 但其Shannon指数为1.87, 最大为1.99。可能是各指数的计算方法不同, 并且群落多样性受群落组成和群落分布情况的共同影响。

对氨氧化微生物的多样性指标与沉积物的理化性质进行相关性分析(表 6), 结果发现东湖沉积物中AOA OTU数量与TOC呈极显著负相关(P＜0.01), 而AOB OTU数量与pH呈显著负相关(P＜0.05)。此外, AOA Shannon指数和AOB Shannon指数也与TOC呈极显著负相关(P＜0.01), 说明沉积物TOC越高, 群落多样性越低。2号位点相对于其他位点TOC含量最高, 所以AOA和AOB的多样性均较低。

2.4　沉积物氨氧化微生物的群落结构分析

高通量测序解析氨氧化微生物群落的组成和多样性结果如图 3—5所示。总体来看东湖沉积物中AOA亲缘关系较近的既有来自水体的, 也有来自土壤和沉积物的, AOA序列可以分为Nitrosopumilus、Nitrososphaera以及其他。各个季节各个采样点之间AOA群落组成有一定的差异, 但是Nitrosopumilus均占绝对优势(99.8%), 仅在1号位点的冬季、春季及夏季检测到了Nitrosospharea存在, 含量很低。AOB amoA基因序列分为来自土壤和淡水环境的Nitrosomonas, Nitrosospira以及相当一部分处于发育树外枝的序列。在东湖不同季节不同采样点采集的12个样品中, Nitrosomonas占55.27%, 其他占44.70%, Nitrosospira含量仅占0.03%。

2.5　环境因子对AOA和AOB群落结构的典范对应分析

利用Canoco将AOA和AOB的优势种与环境因子进行典范对应(CCA)分析(图 6)。东湖AOA群落结构与环境因子排序轴AX1和AX2的解释度分别为80.6%和9.14%。TOC (-0.9999)、TP (-0.9872)与AX1的相关性较高;-N (0.6545)与AX2的相关性较高。AOB优势种与环境因子的结果表明, 排序轴AX1的解释度为88.5%, 排序轴AX2的解释度为2.70%。与AX1相关性高的环境因子有TP(-0.9984)、TN (-0.9798)、TOC (-0.9933), 与AX2轴相关性较高的环境因子为温度(-0.9631)和pH (0.7244), 总体而言, TN是影响东湖沉积物AOA群落结构的主要因素, TOC和TP是影响AOB群落结构的主要因素。

表 4　沉积物中AOA的多样性指数Tab. 4　Diversity index of AOA in sediments

表 5　沉积物中AOB的多样性指数Tab. 5　Diversity index of AOB in Sediments

表 6　AOA和AOB的多样性指数与沉积物理化指标相关性分析Tab. 6　Correlation analysis between the diversity index of AOA and AOB and physical and chemical indicators in sediments

3　讨论

已有研究表明, AOA比AOB更适合厌氧或低氨氮浓度条件[19], 在海洋生态系统[20]和土壤环境中[21]AOA amoA基因比AOB的丰度高3个数量级。在淡水生态系统中, Hou等[22]分析了太湖和巢湖不同富营养程度点位中沉积物AOA与AOB丰度, 发现在中营养采样点中AOA多于AOB; Yang等[23]发现在洱海的沉积物中, AOA数量多于AOB。这与本研究在东湖沉积物中AOA和AOB丰度的研究结果类似, 携带amoA基因的微生物并不足以说明其参与氨氧化过程, 因此无法仅仅以基因丰度含量高低确定AOA和AOB在氮循环中的具体贡献, 但目前还没有发现不能进行氨氧化过程的此类微生物[24],AOA可能在东湖生态系统氨氧化中占主要作用。

湖泊沉积物中的AOA和AOB受多种环境因子的影响, 现有研究发现AOA丰度受pH[25]、-N[26]、-N[27]、TN[26]、TP[27]及TOC[28]的影响,AOB的丰度受-N[29]、-N[26]、pH[26]的影响。在本研究中, 东湖沉积物AOA丰度在不同季节存在显著差异, 其数量与温度呈显著负相关。Lu等[30]研究农业池塘沉积物AOA群落分布时, 也得到相似的结论。Hou等[31]研究了东湖不同富营养化程度子湖郭郑湖和团湖AOA群落分布, 发现AOA丰度与沉积物中有机物的含量呈负相关, AOA丰度对环境因子变化敏感。本研究中考察了季节尺度, 方差分析表明不同季节之间TN、TP、-N均有显著差异(P＜0.05), 使得温度对AOA数量的影响更为明显。pH[32]被认为是影响AOA和AOB amoA基因数量的一个重要环境因子, 但是在本研究中, pH对沉积物中AOA和AOB的amoA基因数量无显著影响。这些不一致的研究结果表明AOA和AOB对于氨氧化过程中的贡献与环境条件密切相关。

利用高通量测序分析了东湖沉积物AOA和AOB的群落结构, 在AOA和AOB中均检测到部分序列(其他)与目前GenBank中已经探明的amoA序列相似性较低, 可能是未分离或培养的区别于已知菌种的新型氨氧化微生物。东湖沉积物AOA Shannon指数介于0.03—0.05, 东湖AOB Shannon指数介于1.34—1.99, 高于AOA, 在淡水湿地[33]、金山湖[27]及太湖[26]沉积物中AOB多样性均较AOA高,AOA多样性较AOB低, 使得优势属的相对丰度和优势度更加明显。李虎等[34]研究了浙江瓯江沉积物中AOA及AOB组成, 发现AOA的shannon指数在2.64—2.89, AOB的shannon指数在2.83—3.56。多样性显著高于东湖, 推测是由于东湖是湖泊生态系统, 环境条件相对封闭单一, 因此生物多样性也较低。河流生态系统具有流动性, 易受周边环境影响,造成了较高的AOA、AOB多样性。Bollmann等[28]研究了不同营养程度湖泊沉积物的AOA组成, 结果表明湖泊的营养程度是影响氨氧化微生物群落组成的重要因素, 富营养湖泊Erie沉积物AOA以Nitrososphaera为主, 寡营养湖泊Superior以Nitrosopumilus为主。东湖沉积物AOA主要为Nitrosopumilus (99.8%), 说明东湖郭郑湖的污染程度相对较轻, 沉积物TN是影响东湖沉积物AOA群落结构的主要因素。对于AOB, Nitrosomonas青睐于低氨氮环境而Nitrosospira更适应高氨氮的污染环境[35], 东湖沉积物AOB主要为Nitrosomonas(55.3%),AOB群落结构主要受TOC和TP的影响, 与Yang等[23]在滇池的研究结论类似。有研究表明AOA和AOB的群落结构多样性受总磷的影响[36], 但Liu等[33]在淡水湿地的研究发现AOA和AOB的群落结构多样性和总磷没有显著相关性, AOA的多样性和有效磷含量显著正相关。到目前为止, AOA及AOB在含磷酸盐生态位中的优势尚未确定。应进一步研究磷酸盐水平与AOA和AOB的存在与活性之间的关系[37]。

图 6　环境因子对AOA和AOB群落结构影响CCA分析Fig. 6　CCA analysis of the effects of environmental factors on AOA and AOB community structure

4　结论

在东湖沉积物中, AOA丰度比AOB高, 沉积物中氨氧化反应可能由AOA驱动。东湖沉积物样品中AOA丰度与T呈显著负相关, 但AOB丰度变化不明显。沉积物中Nitrosopumilus为优势AOA菌, 沉积物TN是影响东湖沉积物AOA群落结构的主要因素; Nitrosomonas为优势AOB菌, 东湖沉积物AOB群落结构主要受TOC和TP的影响。

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