乳腺癌微钙化形成的分子机制

张 瑜，王 文，米成嵘

宁夏医科大学1临床医学院,2总医院心脑血管病医院超声科,3总医院超声科，宁夏 银川 750000

据统计，2011年乳腺癌占全球女性新发癌症的26%左右，占女性癌症死亡人口的14%左右[1]。医学影像技术的发展实现了临床诊断早期乳腺癌的可能性，其中，无论是钼靶还是超声都很容易探及的一个乳腺恶性征象便是乳腺微钙化（MC）。美国放射协会乳腺影像报告和数据系统（BI-RADS）将MC定义为超声或X线钼靶摄影上直径小于1 mm的钙化，后方通常不伴有声影。而首次提出乳腺癌MC概念的是在1913年对离体乳腺标本进行X线检查时发现了这一征象[2]。1951年，放射学家Nalawade[3]首次提出，MC或许是乳腺恶性肿瘤的唯一征象。从此以后，大批研究人员致力于乳腺MC的研究，为乳腺恶性肿瘤的诊断及预后评估提供了大量的证据。而对于MC的形成机制人们却了解甚少，本文将对乳腺癌MC形成的分子机制做一较全面的总结。

1 乳腺癌MC的化学成分

在乳腺组织中常见两种类型的MC物质。I型是双水草酸钙（CaC2O4·2H2O），HE染色不着色，光镜下表现为琥珀色，并具有强屈光率，常规组织学检查很难观察到，只有运用偏光显微镜才能捕捉到。II型是羟基磷灰石[HA，Ca10（PO4）·6H2O]，光镜下表现为灰白色，HE染色为碱性蓝染。一些研究认为MC生化成分的构成与疾病状态有关。在Scimeca等[4]的研究中，使用能量弥散型X线分析仪对66例MC穿刺标本进行了超微结构分析，从而第1次证实，羟磷灰石主要存在于乳腺恶性病变中，而草酸钙主要存在于良性病变中。而在Haka等[5]的研究中，I型钙化被认为几乎只在乳腺囊肿内出现，很少发生于癌，而II型MC物质通常出现在增生性病变中，包括良性和恶性疾病。良性增生性病变内的钙化同时含有较高水平碳酸盐，而恶性病变内只含有较纯的羟磷灰石钙成分[6]。Baker[7]应用红外显微镜对来自于110例患者的236个MC样本进行分析发现，MC的生化成分与病变的等级具有显著相关性，在乳腺良性病变组、导管原位癌组及浸润性导管癌组中，MC内碳酸盐含量逐级减少，而蛋白含量逐级增多，在导管原位癌中，随着组织学级别的升高，也可出现类似趋势。Liang等[8]应用拉曼光谱对乳腺纤维腺瘤、乳腺癌前病变及乳腺原位癌内的钙化成分进行分析，发现乳腺病变恶性程度越高，蛋白质、氨基酸残基、类胡萝卜素和核苷酸等钙化成分越多。

2 HA与乳腺癌的关系

Morgan等[9]对MCF-7和Hs578T乳腺癌细胞系进行的体外研究实验首次从分子水平揭示了HA与乳腺癌的关系，HA具有诱导乳腺癌细胞有丝分裂的潜力。Cox等[10]的一项最新研究显示，乳腺癌细胞系Hs578T的浸润性亚克隆细胞群其钙化能力（HA水平）高于其母代细胞及正常乳腺上皮细胞，而乳腺肺转移癌细胞4 T1钙化的发生也早于浸润性乳腺癌细胞系Hs578T亚克隆群。这些研究结果表明MC可以作为乳腺恶性肿瘤强有力的预测因子，且对乳腺癌恶性程度的评估具有一定参考价值。

3 基质小泡在乳腺癌MC形成中的作用

基质小泡（MVs）的合成是乳腺癌MC形成过程中的重要环节。MVs是一类小的（20～200 nm）膜状脂质封闭结构，存在于具有成骨功能的细胞中，如成骨细胞、软骨细胞、胚胎干细胞等，对于MVs的发生机制有各种假说。其中最广泛被采纳的观点是MVs在钙化形成过程中通过出芽的方式从细胞膜特定部位脱离出来[11]。许多研究表明，乳腺肿瘤细胞也产生MVs[12]。MVs脂质膜成分与其来源的细胞膜成分显著不同。MVs的脂质膜富含组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）、磷脂酰丝氨酸（PS）、膜联蛋白、NaPi转运体、核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶1（NPP1 PC1）及磷酸酶（PE/PC磷酸酶），这些蛋白质结构能够为MVs转运Ca2+和PO43+，促进HA单晶的形成。这些MVs将新合成的HA单晶从细胞内转运到细胞外，在细胞外液中形成成熟的HA结晶钙[13-15]。而HA单晶如何转变为成熟的HA结晶钙还是未知的。

MVs在正常生理性钙化和异位病理性钙化过程中均可出现。利用透射电子显微镜发现在小鼠动脉粥样硬化和人类纤维帽中均存在MVs[16]。此外，最近New等[17]发现动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞也能够合成和分泌MVs，加速了动脉粥样硬化斑块中钙化的形成。这些发现均表明，MVs在不同的组织器官的的病理生理矿化过程中发挥着重要作用。

4 乳腺癌MC的发生与MVs的关系

如上文所述，乳腺肿瘤细胞也能够产生MVs。但尚没有报道解释乳腺癌细胞MVs的具体组成成分或者乳腺肿瘤细胞MVs的脂质膜成分是否与成骨类细胞的MVs成分相同。最近研究发现，骨肉瘤细胞分泌的MVs与成骨细胞MVs的成分相同[18]。据报道，乳腺癌细胞膜中的MVs成分较对照组正常乳腺上皮细胞显著增高，如瞬时感受电位（TRP）阳离子通道、膜联蛋白A2、A4及A5等[19]，富含这类蛋白结构的细胞膜结构域脱离胞体形成MVs，为乳腺癌MC的形成提供大量Ca2+。类似研究还发现与正常乳腺上皮细胞相比，乳腺癌4 T1细胞通过NaPi-IIb（SLC34A2）协同转运蛋白的高表达积累大量PO43+，且经过Na-Pi转运蛋白抑制剂膦酸处理后，钙化过程即会终止[20]。

转移性癌细胞/组织与非转移性癌细胞/组织相比，MVs的许多成分（如TRP阳离子通道，膜联蛋白等）表达均有所升高；浸润性导管癌与非浸润性导管癌相比，Ca2 +通道（TRPM7和TRPC1）的表达水平也较高[21]。更有证据直接显示乳腺癌细胞中TRP阳离子通道7表达水平的升高能够延长乳腺癌细胞寿命，促进细胞增殖，迁移和转移[22]。

综上所述，与其他组织器官相同，乳腺肿瘤组织的MC也是在MVs中生成。且大量研究结果均支持转移/浸润性乳腺癌细胞与非转移/浸润性乳腺癌细胞相比，MVs含量更高，具有更强的形成病理性钙化的能力。MVs的成分能够促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移。

5 乳腺癌细胞向成骨样细胞转变

无论任何组织细胞发生病理性钙化时都会首先转变成骨样细胞，表达上述骨转录因子、ALP及骨基质蛋白以模拟生理性钙化过程的方式产生病理性钙化。例如在动脉粥样硬化疾病中部分血管平滑肌细胞转变成成骨样细胞产生钙化沉积于动脉管壁[23]。同样，乳腺肿瘤组织中MC的形成与肿瘤细胞向成骨样细胞的转化密切相关。许多文献报道自乳腺癌患者肿瘤组织中能够分离出成骨样细胞及成软骨样细胞成分，这类细胞高度表达ALP、OPN等成骨相关蛋白[24]。在LCC15-MB和MDA-MB-231乳腺癌细胞系中均能够发现正常乳腺上皮细胞中不存在的Runx2活性[25]。在MCF-7、T47-D、SKBR3和ZR75-1乳腺癌细胞系中，Msx2的表达水平均较正常乳腺上皮细胞高[26]。MCF-7乳腺癌细胞系经分化诱导剂17β-雌二醇处理后表达ALP[27]。Cox等[20]的最新研究结果显示经成骨细胞诱导剂处理转移性乳腺癌细胞系4 T1和正常乳腺上皮细胞系MCF10A后，前者高表达ALP，而后者不表达，且4 T1细胞经ALP抑制剂左旋咪唑处理后钙化过程即减缓。这些数据均表明，在特定微环境下部分乳腺癌上皮细胞转变为成骨样细胞参与乳腺癌MC的形成。

另外，还有研究发现对比乳腺癌组患者与对照组患者，乳腺癌骨转移组患者与无骨转移组患者，晚期乳腺癌组患者与早期乳腺癌组患者或健康对照组人群，前者血浆ALP水平更高[28-29]。还有文献报道浸润性癌OPN及BSP的表达水平高于非浸润性癌[30]。乳腺癌患者血浆中ALP、OCN及BSP水平均较乳腺良性肿瘤患者的血浆水平高[20]。这类证据也提示乳腺癌恶性程度越高其钙化能力越强，进一步为MC评估乳腺癌恶性程度提供了依据。

6 乳腺癌细胞通过上皮间质化进程获得成骨细胞特征

乳腺癌组织中部分异质性细胞亚群发生上皮间质化（EMT）从而获得了更高的侵袭性及转移能力。浸润性乳腺癌MDA-MB231细胞显示其表达的骨转录因子Runx-2水平高于非浸润性乳腺癌细胞MCF-7，而前者在性能上更趋于间质化[31]。同样，MDAMB231细胞Runx-2DNA结合活性也高于乳腺正常上皮细胞[32]。Hassan等[33]的研究显示小RNAmiR-218通过增强Runx-2的表达能够提高癌细胞的间质性并促进乳腺癌的转移能力，证实了Runx-2表达水平与癌细胞的间质性及转移能力密切相关。异位表达的Runx-2能够促进间充质干细胞向成骨细胞转化[25]。因此，Runx-2的表达能够增加乳腺癌细胞的侵袭性能并促进肿瘤细胞向成骨样细胞的转化。

另外一个骨转录因子Msx-2同样也作为肿瘤细胞间质化及侵袭力的诱导因子在肿瘤组织中高表达，Msx-2的过表达还能够抑制细胞生长，表明Msx-2的促间质化功能或许是通过抑制细胞生长来实现的。更重要的是，Msx-2的表达水平还可提示肿瘤的恶性程度，随着肿瘤自良性向恶性过渡，其表达水平不断提高。与Runx-2相同，Msx-2也能够促进间质化细胞向成骨细胞转化[34]。

成骨细胞是由间充质细胞分化而来，与此类似，上述研究结果证实在乳腺癌进展过程中，部分表皮样细胞在骨转录因子的驱动下通过间质化进程获得间充质细胞表型，其中部分间充质细胞同样在骨转录因子的调节下再转化成成骨样细胞。另一研究结果也支持这一观点，该研究发现在含微钙化的浸润性癌组织中间充质细胞表面分子（如波形蛋白、β-连环蛋白等）及成骨相关蛋白（如OPN、OCN等）均高于无微钙化浸润性癌组织[4]。

7 骨形成蛋白在乳腺癌细胞向成骨样细胞转化中的作用

越来越多的证据显示骨形成蛋白-2（BMP-2）在乳腺癌MC的形成过程中起关键作用。BMPs（除BMP-1外）属于多功能生长因子—转化生长因子（TGFs）家族。早期研究发现，BMPs是有效的骨形成诱导剂，作用于软骨、骨及动脉管壁等不同组织的生理及病理性钙化[35]。

Sando等[24]研究发现，经BMP-2处理过的4 T1转移性乳腺癌细胞钙化能力增强。另一个研究小组观察发现将过表达BMP-2的R3230大鼠乳腺癌细胞接种到脂肪垫，大鼠将长出含微钙化的乳腺癌瘤体，而普通的R3230细胞并无此功能。该小组同时发现经重组BMP-2处理过的荷瘤大鼠，其所有癌组织内均生成微钙化[36]。所有这些证据显示BMP-2能够诱导钙化性乳腺癌的生成。 Liang等[8]的研究结果表明相比于不含微钙化的浸润性乳腺癌，含微钙化的浸润性乳腺癌BMP-2水平上调，并且高度表达间充质细胞表面分子及成骨相关蛋白。更有证据直接显示BMP能够增加TRP阳离子通道的表达，进而促进乳腺癌细胞MVs对Ca2+的摄取及MC的形成[37]。Bragdon等[38-39]对BMP的信号传导途径进行研究发现，通过非经典信号传导途径，BMP主要执行延长细胞寿命、促进有丝分裂、诱导EMT的功能，而通过经典Smad信号传导途径，BMP主要执行促进骨转录因子的表达和EMT细胞钙化的功能。许多研究还发现BMPs在特定环境下还可抑制癌细胞增殖，但同时也能够促进乳腺癌细胞的转移和浸润[40]，这一特点可能是基于BMP的促上皮间质化功能。另外，最近还有文献报道血浆BMP水平与乳腺癌转移及晚期乳腺癌具有相关性[41]。

8 肿瘤相关巨噬细胞加速微钙化的形成

乳腺癌肿瘤组织成分包括肿瘤细胞、肿瘤干细胞以及非肿瘤细胞，其中非肿瘤细胞主要包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。乳腺癌肿瘤细胞能够分泌多种炎症介质，如CCL2、CCL5、CSF-1等，招募巨噬细胞至肿瘤组织处，这类由肿瘤组织的趋化作用集聚的巨噬细胞称为TAMs，该过程进一步加剧了肿瘤的恶性程度。据报道，转移性乳腺癌细胞比非转移性细胞分泌更多的CSF-1[42]。血浆CSF-1的浓度与多种肿瘤的恶性程度相关，如子宫内膜癌、乳腺癌以及卵巢癌[43]。这类巨噬细胞在乳腺癌MC的形成中也起了关键作用，它们能够产生MVs从而为MC的形成提供大量HA单晶[44]。在另外一些研究中对乳腺癌组织进行活检发现MC周围存在大量巨噬细胞[45]，这一结果也验证了上述观点。因此可以得出结论，TAMs在乳腺癌MC的形成中也起了一定的作用。

9 微钙化的形成机制

基于上述所有观点，为乳腺癌微钙化的形成机制做一总结：在特定微环境下，部分异质性乳腺癌上皮细胞在BMP和骨转录因子的作用下发生EMT继而获得成骨细胞特征，这类成骨样细胞在特定程序下高度表达NaPi-IIb转运体、NPP、TNAP、TRPC及阳离子通道等膜蛋白，此后富含这类蛋白分子的脂质膜微结构域从细胞膜脱离出来形成细胞内的MVs结构，MVs摄取大量Ca2+和PO43+，并将它们转运至细胞外基质形成HA单晶。最后HA单晶与骨基质蛋白沉淀为成熟HA结晶钙，而HA单晶转变为成熟HA结晶钙的机制尚未阐明。另外BMPs能够促进乳腺癌细胞凋亡，这些凋亡小体也能够诱导MC的生成。同时BMPs能够抑制乳腺癌细胞增殖，阻碍肿瘤生长，该过程往往同时伴随肿瘤上皮细胞的EMT。此外，炎症介质如CSF-1、CCL2、CCL5等的产生趋化大量肿瘤相关巨噬细胞生成MVs，为MC的形成提供HA单晶核心。

10 展望

大量基础及影像学研究致力于探讨乳腺癌MC对乳腺癌预后的诊断价值，已经有部分文献指出乳腺癌MC可以做为乳腺癌恶性程度的预测因素，然而还需要更多的研究结论来佐证。已知在BMPs及骨转录因子的驱动作用下乳腺癌细胞发生EMT获得成骨功能从而启动MC形成过程，但其具体的分子机制还有待阐述。ALP、OPN、BMPs等骨形成相关蛋白将来可能作为乳腺癌发生发展过程中血清学的一个潜在生物学标志来评估乳腺癌风险。未来的研究还将关注于靶向作用于微钙化的新型乳腺癌治疗手段，乳腺癌通常发生于绝经后女性，女性通常在这个年龄将增加罹患骨质疏松的风险，因此，这类治疗药物必须同时满足靶向作用于乳腺癌MC且不使全身骨量受损。