3D生物打印在口腔颌面部的应用前景

姚 洁，蔡礼钊，刘湘宁，王亚玉，赖仁发

暨南大学1口腔医学院,2生命科学技术学院/生物医药研究院，广东 广州 510630

对于创伤、肿瘤和遗传等因素导致的颌面部软硬组织缺损及畸形的修复，一直是口腔医学的临床难题。近年来，随着再生医学、生物材料学科及计算机科学的飞速发展及融合，修复颌面部组织缺损的研究热点已转向仿生材料修复以及组织器官的再生修复。3D生物打印技术的发展正印证了这一学术潮流。以组织器官的再生修复为目标的3D生物打印为颌面部组织的精细化修复带来了新的思路和希望。本文围绕着3D生物打印在口腔颌面部的应用进展进行简单概述。3D打印的概念在1986年首次提出，3D打印的作用原理即将材料薄层打印出后再用紫外光固化，叠加在一起，得到三维立体模型[1]。3D生物打印则是引用3D打印的理念，利用生物材料或者活细胞逐层叠加构造，形成一定的仿生形态或细胞微环境，即形成具有三维立体结构的生物功能体[2]。

1 纯生物材料生物打印（无生命的）

单纯的生物材料打印不涉及细胞的打印，常见生物材料分为金属和非金属材料[3]（医用高分子、生物陶瓷、生物衍生材料等）。常用的金属材料包括纯钛和钛合金、镁及镁合金，多用于牙种植以及颌面骨缺损的修复。Qassemyar等[4]在两位分别因成釉细胞瘤和鳞状细胞癌造成下颌骨缺损，需要进行骨重建但无法从自身提取骨游离皮瓣的患者身上，利用3D生物打印定制了多孔钛假体，从而代替骨游离皮瓣进行修复。大多数金属生物支架是不可降解的，不经手术难以取出，往往给患者带来二次伤痛以及经济负担。这也使研究人员对生物可降解金属的产生了浓厚兴趣。Wang等[5]将AZ31型镁合金设计成牵引装置，在切除单侧下颌骨的杂交犬身上进行牵张成骨实验。研究分别用AZ31镁合金和不锈钢作对照，结果显示新型生物材料AZ31镁合金对成骨的诱导结果与不锈钢相似，在生物体内可以降解，对肝、肾无毒性作用。研究人员还在研究如何控制生物材料的降解速率，如Hong等[6]通过3D打印精确控制生物可降解铁锰合金中钙的含量，发现钙可以提高传统的铁锰合金的降解速率，相信在不远的将来，3D生物打印的可降解铁锰-钙合金在骨缺损修复确有可行之处。

非金属材料常见的有生物陶瓷、医用复合材料、生物衍生材料等[3, 7-9]；其中又以生物陶瓷最为常用，生物陶瓷是一类与人体骨组织成分相似，可以诱导骨的形成的材料[8]，常用的生物陶瓷成分主要有羟基磷灰石和磷酸三钙。羟基磷灰石是骨和牙齿的主要成分，作为人工骨的早期替代材料，其生物相容性良好，但强度低、脆性大；磷酸三钙作为人体硬组织修复材料则具有良好的生物相容性和降解能力[7]。将二者的特性结合起来，制作具有二者优点的复合材料的研究从未间断。研究人员利用3D打印技术制备由羟基磷灰石/β-磷酸三钙（HA/β-TCP）组成的双相磷酸钙陶瓷（BCP）支架，研究其在骨组织工程中的应用潜力，发现骨髓基质干细胞在此支架上黏附良好[10]。Gašparič等[11]将羟基磷灰石和纳米纤维素结合，并进行疏水化处理，研究其与人成骨细胞的相容性，发现成骨细胞在支架材料与胶原/磷灰石基质上具有相似的生存能力。将含有银离子的磷酸三钙支架运用在颌面部缺损修复中，可持续性提供银离子释放，在一定程度上缓解术后感染的风险[12]。

这些生物材料根据不同的要求，通过不同的3D打印技术，例如喷墨打印技术、选择性激光烧结技术、光固化成型技术和熔融沉积技术等，在体外可以形成具有一定生物功能的生物医学产品。

2 以活细胞为基础的生物打印（有生命的）

有研究2003年提出了“细胞打印”的概念，随后形成了以活细胞为基础的3D生物打印技术，即将活细胞和生物支架材料混合输出并逐层叠加，形成具有三维立体结构的有生命的生物功能体[1]。到目前为止能进行3D打印的细胞种类繁多，已经涉及到人体的组织的各类细胞，例如成骨细胞、骨髓基质干细胞、微血管内皮细胞、人类纤维组织细胞和人脂肪干细胞等[13-16]。根据打印方式的不同细胞打印通常可以分为喷墨打印、激光直写、声控打印[15, 17-18]。以细胞打印为基础的3D生物打印是最前沿的生命科学技术，以此为基础的人工组织与器官构建技术具有巨大的科学意义与应用价值。

2.1 细胞打印的方式

2.1.1 喷墨打印 喷墨打印目前应用广泛，是最早应用于细胞打印的技术之一，它是一种非接触式的打印方式。喷墨打印的“生物墨水”是一种包含了活细胞、细胞培养基质以及其他生物物质的一种共混物。最常见的喷墨产生方式是利用机器腔内的热应力产生挤压力，使喷头喷出定量的墨水，或是利用压电晶体在电压作用下发生形变，产生压力，将墨滴喷出喷嘴，精确控制液滴位置。喷墨打印虽然技术难度不高，分辨率好，然而也存在技术短板：若使用的“生物墨水”较为粘稠，不仅容易导致喷墨沉积不均匀，喷墨打印机的喷嘴很容易被堵住，这是研究人员需要克服的难关。

2.1.2 激光直写 激光直写，是利用激光束对细胞的作用力，使细胞发生移动，到达指定的位置。该打印系统主要由脉冲激光束源、聚焦系统、目标板和接收板组成。3D生物打印激光直写为防止激光对细胞直接作用，采用可吸收紫外光的目标基板吸收激光束的能量。在其下方则放置一块接收板。在打印过程中，利用激光聚焦于目标板上，将细胞悬液打到接收板上面，从而完成打印。这种打印方式的分辨率高，精确度好，细胞与细胞之间不会发生污染，是完全没有堵塞喷嘴风险的打印方式。但同时，效率低下和激光造成细胞损伤、溶液蒸发的问题也困扰着研究者。

2.1.3 挤压打印 挤压打印可用于高粘度的生物墨水打印，通过机械螺栓或者气动装置挤压液体腔，长丝从喷嘴里连续流出。印刷速度由气动压力以及机械螺栓的位移决定。此种打印方式准确，连续且成本低。然而对压力敏感的细胞打印成活率低的问题难以解决，高浓度的生物墨水依然容易造成喷嘴堵塞。

2.2 细胞打印的支架材料研究

以活细胞为基础的生物打印的组成材料为活细胞和生物支架材料，生物支架材料显得格外重要，一方面要求与细胞有很好的相容性，具有良好生物降解功能，另一方面，需要一定的强度，供细胞粘附增殖。常用的支架材料有水凝胶、纤维蛋白原等。宋杨等[19]构建了人脂肪间充质干细胞-生物材料共混物三维打印体，获得的细胞—海藻酸钠一明胶共混物经过体外培养一周，将其植人裸鼠背部皮下。结果显示实验组打印体中有类骨组织形成。Yang等[20]用海藻酸钠（SA）混合的胶原型I（COL）或琼脂糖，作为3D生物墨水，结合软骨细胞构建体外3D生物打印软骨组织，结果显示SA/COL可以明显促进细胞粘附，加速细胞增殖。Pati等[21]利用脱细胞的脂肪组织和人脂肪组织干细胞制作生物墨水，经3D生物打印后体外培养后植入小鼠后背，该结构没有引起慢性炎症反应，反倒是促进了局部组织重建和脂肪组织形成。有活细胞参与的3D生物打印，往往比单纯的支架材料植入效果好，具有一定增殖、自我修复功能，可促进局部组织愈合，提高组织重建能力，以期恢复组织结构的生理功能。细胞打印是日后组织器官重建与移植的基础。

3 以3D生物打印为基础的组织器官构建

目前可以经过3D生物打印的器官组织有肝脏、肾脏、皮肤、血管等。研究表明，大多数体外肝脏组织模型只能模拟二维环境，在较短的时间就会丧失功能，Grix等[22]利用肝素和人星状细胞结合，用3D生物打印的方式，组成一个复杂的三维结构，经过两周培养，各项生化检测显示正常。Kizawa等[23]利用无支架的3D生物打印技术构建一小部分肝脏组织，可稳定代谢药物、葡萄糖和脂质。Sochol等[24]讨论了体外单层肾脏模型可利用3D打印技术，形成具有功能替代性的结构。不少研究者着眼于皮肤这一身体中最大的一个器官，有学者研究了一种可引导皮肤再生的生物墨水混合细胞进行皮肤组织打印，实验证明3D生物打印的皮肤组织物理形态稳定，没有明显萎缩[25]。单纯打印血管组织并不困难，难点在于植入体内后发挥运输功能，Lee等[26]对3D生物打印血管网系统的生成进行了研究，成功研制出一种3D打印的射血通道，可与附近的毛细血管网建立灌注血管通道。至此，可见3D生物打印技术取得了一定的发展。

然而，诸多3D生物打印的产物目前只是在体外实验获得成功，目前的组织器官尚不能用于人体，在人体内行使功能。人体器官具有复杂性和多样性，在人体内部构成一个有机整体，内部环境需要血管网络相交通，以传递营养。如今的3D打印技术能够很好的实现细胞的空间位置排布，但实际上是缺少血管网这类有效通道结构的。刘翀等[27]就利用现有的三维支架，利用计算机模拟，在其上建立模拟血管通路，以期得到包含血管通路网的三维支架。而Jia等[28]利用明胶、海藻酸钠和4-arm聚乙二醇组成的生物墨水，与多层同轴挤压系统结合使用，经过细胞增殖，形成了具有生物组织性、可灌注的血管结构。组织的血供完善是3D生物打印发展道路上亟待解决的问题，若能解决这个问题，颌面部修复中关于皮肤移植的难题也能迎刃而解[29]。

4 3D生物打印在口腔颌面部的应用前景

目前3D打印在口腔颌面部应用较为局限，主要是纯生物材料的3D打印，例如钛金属经3D打印成种植体精确性良好，有报道称钛合金根形种植体在临床应用中获得成功[30]，有效地利用金属或非金属的生物材料打印为颌骨支架，如王宁等[31]就利用3D纯生物材料打印技术，打印了钛合金下颌骨，为因切除左下颌骨肿瘤造成骨缺损的患者进行颌骨重建。Lee等[32]则利用纳米羟基磷灰石/聚酰胺（n-ha/PA）作为支架材料修复了髁状突缺损，恢复了面部外形。这类技术的运用为颌面部缺损修复提供便利，节省手术时间，提高了修复效果。颌面部骨组织外侧有层层包裹的肌肉、皮肤，其中有错综复杂交叠的血管和神经。对于以活细胞为基础生物打印，涵盖了软骨及骨组织、皮肤、血管、神经等组织的相关打印技术，同样适用于口腔颌面部软骨及骨组织、皮肤、血管、神经等组织的重建。Li[33]发现关节软骨内提取内源性的祖细胞（ACPCs）可经3D生物打印用于颞下颌关节盘损伤修复。

综上所述，3D生物打印是纯生物材料的打印，同时包含了以活细胞为基础的生物打印。3D细胞打印可通过喷墨打印、激光直写、挤压打印等方式在细胞多样性的选择及三维构筑结构的精确性上有很大进步，但仍需克服诸如复杂结构的多细胞打印、直径大液滴打印等问题。如今已有体外构建有功能的人体组织器官的报道，随着新型生物材料的更新和细胞支架材料制造技术的发展，相信随着科技的不断发展，以组织器官的再生修复为目标的3D生物打印为颌面部组织的精细化修复是口腔颌面部组织修复的必然发展方向，有着广阔的科学研究和临床应用前景。