结核杆菌感染过程中调节性T细胞功能变化研究

何军兰 王永斌 贾忠 同重湘 韩建军

【摘要】目的 探讨结核杆菌感染过程中调节性T细胞的功能变化及其临床意义。方法 选择150例研究对象，根据实验纳入标准分为5个试验组。采集外周血液，分离单核细胞后用ESAT-6抗原刺激48 h并进行染色，染色后进行流式细胞法测定样本中CD4+ T细胞、CD8+ T细-胞和FoxP3+的阳性率。同时采用ELISA检测IL-2、IFN-γ、TGF-β和穿孔素指標变化。结果 流式细胞阳性率测定结果为：健康组<未治疗活动性结核组<治疗中活动性结核组<潜伏感染组<治愈组；ELISA测定结果为：IFN-γ组间比较（P>0.05）。IL-2、TGF-β及穿孔素总体指标变化规律为：健康组<治愈组<潜伏感染组<未治疗活动性结核组<治疗中活动性结核组。结论 通过对不同组别免疫指标对比发现MTB感染者不同疾病阶段或病理状态下Tregs功能的变化，从而为临床结核病情提供判断。

【关键词】结核分枝杆菌；调节性T细胞；流式细胞法；功能；免疫

【中图分类号】R725 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.3..02

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的传染性疾病[1]。机体在抵抗MTB的免疫过程中，T细胞介导的细胞免疫发挥主要作用。T细胞亚群根据功能不同可分为调节性T细胞（Regulatory T cells，Tregs）、辅助性T细胞细胞、细胞毒性T细胞等，其中Tregs在MTB慢性感染及发病过程中发挥重要作用[2-3]。本文旨在通过对健康人群与结核患者特异性免疫指标的变化对比。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年3月始兰州市肺科医院患者150例。根据下列纳入标准分为5组：①对照组：T-SPOT试验阴性的未感染MTB的健康人或患者，排除患有结核，无明显结核暴露史。②MTB潜伏感染者：T-SPOT试验阳性的无临床症状的MTB感染者。③未治疗的活动性肺结核患者：根据临床症状、胸片或痰涂阳性确定为肺结核者，尚未进行抗结核治疗。④抗结核治疗3个月的活动性结核患者：持续抗结核治疗3个月的活动性肺结核患者。⑤治愈的结核患者：活动性肺结核经抗结核治疗后临床痊愈者。均为30例。

1.2 方法

1.2.1 靶标选择

Tregs群中，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞对机体抵抗MTB感染中发挥了主要的免疫应答作用。Tregs分泌的肿瘤生长因子TGF-β可缓冲炎症反应，保护机体组织[4]。

1.2.2 试验方法

1.2.2.1 不同疾病阶段Treg表型变化

采集外周血10 mL，计数、洗涤方法同上，用RPMI1640培养基调整细胞浓度至所需浓度。将单个核细胞接种于96孔板，每孔5×106个细胞，加入2.5 ?g/ml的抗原ESAT-6刺激48h，利用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）检测CD4、CD25、Foxp3、CTLA-4和GITR等

分子[5]。

1.2.2.2 不同疾病阶段Treg抑制效应T细胞的能力

采集外周血10 mL，计数、洗涤方法同上，用结核抗原ESAT-6刺激的同时加入达利珠单抗注射液（抗人CD25抗体）以抑制Tregs，培养后对细胞表面分子（CD4、CD8）的染色，经过固定、透膜后再染细胞内的FoxP3分子，染色后样品以FACS calibur流式细胞仪检测；收集细胞培养上清，应用ELISA测定反映Treg功能的细胞因子TGF-β、IL-10和反映效应T细胞功能的免疫分子IFN-γ、TGF-β、IL-2、TNF-α、穿孔素。

2 结 果

2.1 调节性T细胞及FoxP3检测

感染MTB的患者（无论是否治愈），CD4+ T细胞明显多于CD8+ T细胞（P < 0.05）。FoxP3+与CD4+ T细胞阳性率无显著性差异（P>0.05），与转录因子FoxP3主要表达于自然调节性CD4+ T细胞说法相符合。流式细胞检测结果组间阳性率比较为：健康组<未治疗活动性结核组<治疗中活动性结核组<潜伏感染组<治愈组。如表1。

说明：FCM-CD4+-ESAT-6指流式细胞法检测对抗ESAT-6抗原的CD4+ T细胞，下同。

2.2 ELISA靶标检测

利用ELISA测定各组别中试验对象的血清中工IL-2、IFN-γ、TGF-β和穿孔素的水平。如表2。

3 讨 论

Tregs在MTB感染过程中发挥重大免疫作用，但同时MTB也可减弱CD4+ T细胞和CD8+ T细胞免疫应答的能力，可通过抑制细胞凋亡延迟Tregs应答以及降低Tregs释放免疫因子的能力。这两点在本实验中也得到了证实，表现在流式细胞检测阳性率结果中活动期阳性率低于潜伏期，以及ELISA测定结果值中各指标相对值的变化。此外，本试验通过对不同组别免疫指标对比，可归纳出MTB感染者不同疾病阶段或病理状态下Tregs功能的变化，从而为临床判断结核病情处于发展、转归、治愈何种阶段提供指导意义，进而给予相应免疫治疗的干预；同时试验也可为今后结核感染免疫制剂的研发提供参考价值。

参考文献

[1] 买月琴.结核患者DC亚群的变化和结核杆菌抗原对DC成熟及调节γδT细胞功能的影响[D].蚌埠医学院，2012.

[2] 董 毅，吴利先.T细胞免疫在抗结核杆菌感染中的研究进展[J].现代生物医学进展，2014，14（18）：3593-3595.

[3] 焦志军，尤海燕，陈 蕾，等.流式细胞术检测表达FoxP3的CD4+ CD25+调节性T细胞[J].临床检验杂志，2008，（3）：161-163.

本文编辑：吴宏艳