载VEGF荧光PLGA亚微米缓释微球的制备及体外控释特性*

周 山，封建立，高 瑾，颜加强，舒 勇，刘元丰，孙道冬

(中国人民解放军第三二四医院肾病泌尿科，重庆 400000)

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种在体内诱导血管生成的细胞因子，当其在组织局部应用，能够增加缺血部位的微血管生成，因此在缺血性疾病(如冠状动脉缺血)、组织工程支架等中有广泛应用[1]。但VEGF半衰期短，体内降解速度快，使其临床应用受到限制[2]。目前广泛采用的解决方案是使用载药缓释微球，使VEGF在组织局部以恒定的释药速率释放，保证组织修复过程中始终保持一定的VEGF水平，从而促进新生微血管的形成。制备的载药微球尺寸由数十纳米至数百微米不等，其中0.5～1.0 μm称为亚微米微球，0.5 μm以下称为纳米微球。体积越小，在脱细胞真皮基质(acelluar dermal martrix，ADM)中缓释时药物分布更均匀，但同等材料下缓释时间会缩短，并且制备难度更大[3]。目前国内少有亚微米聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)微球的制备与性质研究，本文提供一种PLGA载药亚微球制作方法，并在其中负载荧光物质，实现微球追踪并研究其体外特性。

1 材料与方法

1.1材料 PLGA(丙交酯∶乙交酯=50∶50；分子量40.6×103,Evonik,德国)，异硫氰酸荧光素4(LWABX021-139911,宝曼生物，中国)，重组人 VEGF 165蛋白(600310，Abbiotec，美国)，VEGF-ELISA试剂盒(ab100663，Abcam，英国)，二氯甲烷(Adamas-01226780，Adamas，中国)，聚乙烯醇(PVA，0520224325，MP，美国)，T25均质器(IKA-Laboratechnik，德国)，LS13 320激光粒度分析仪(Beckman Coulter，美国)，真空冷冻干燥仪(LDGZJ28，北京松源华兴，中国)，扫描电子显微镜(HT7700，日立，日本)，激光共聚焦显微镜(LSM510，Carl Zeiss，德国)。

1.2方法

1.2.1PLGA荧光载VEGF微球制备 采用复乳溶剂蒸发法(W/O/W)制备PLGA亚微米微球[4]。0.4 g PLGA溶于10 mL二氯甲烷作为油相(O)，0.2 mg VEGF加2 μg绿色荧光素溶于2 mL去离子水中作为内水相(W1)，外水相(W2)为50 mL的PVA(8%，w/v)。将W1 倒入O中，在15 000 r/min速率下均质5 min后形成W1/O，迅速倒入W2中形成复乳(W1/O/W2)，磁力搅拌器固化6 h(400 r/min)。固化后使用去离子水清洗数次，冻干，获得微球。

1.2.2微球粒径测量及形貌观察 取少量制备好的PLGA微球悬浮于水中，振荡使其均匀分散，加入激光粒度分析仪样品池中，进行测量。Span值表示粒径分布，Span值越大表明颗粒尺寸越不均一。取适量冷冻干燥的 PLGA 微球溶于适量水中，吸取少量悬液滴于锡箔纸，晾干，表面喷金处理，扫描电子显微镜观察其形貌[5]。将PLGA微球悬浮于水中，在倒置相差荧光显微镜下观察PLGA微球尺寸，以及荧光强度，并在不同时间观察微球降解情况。

1.2.3包埋率及装载率测量 称取VEGF缓释微球冻干粉2 mg溶解在200 μL二甲基亚砜(DMSO)中，萃取VEGF，VEGF的水平通过定量ELISA试剂盒测定。依据试剂盒说明书操作。VEGF装载率和包埋率由以下公式计算[6]：VEGF装载率(%)=(微球的VEGF质量/微球质量)×100%；VEGF包埋率(%)=(测量VEGF装载率/理论蛋白装载率)×100%。

1.2.4体外VEGF释放研究 精确称取微球2 mg装于EP管，以磷酸盐缓冲液(PBS，100 μL)作为释放介质，加入0.1% BSA作为稳定剂，0.8%(w/v)甘露醇作为湿润剂，37 ℃恒温振荡，分别在1 h、6 h、1 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d收集上清液。上清液中的VEGF水平通过VEGF-ELISA试剂盒测定。计算出累计释放量，绘制载VEGF-PLGA微球累计释放曲线。

1.3统计学处理 应用 SPSS13.0软件行统计学分析，使用Excel制作图表。

2 结 果

2.1载VEGF荧光PLGA亚微米微球粒径与形貌观察 在扫描电镜下，制备的微球呈圆球形，表面光滑，尺寸大小不一，但粒径分布范围较窄(图1)。激光共聚焦显微镜可见微球荧光分布均匀，微球在水中分散度好，无粘连(图2、3)。微球粒径分布见图4，微球粒径为0.72 μm，Span值为1.127，表明制备的微球粒径较为均匀。

图1 微球扫描电镜成像

2.2包埋率及装载率 将2 mg载药微球完全溶解，萃取出全部VEGF并测量，由包入微球的VEGF总量与总VEGF量百分比计算出包封率为51.42%，由包入微球内的VEGF量与微球质量百分比计算出载药率为3.91%。

2.3微球降解观察 2周之后，部分微球表面开始出现膨胀、侵蚀、变形，微球之间出现粘连，另有少量微球崩解，另一部分微球形状继续保持原状(图5)。激光共聚焦显微镜下微球聚集严重，部分微球膨胀、崩解后导致荧光面积变大(图6)。

图2 微球激光共聚焦显微镜扫描(白光)

图3 微球激光共聚焦显微镜扫描(绿色荧光)

图4 VEGF微球粒径分布图

2.4微球体外VEGF释放研究 将PLGA微球置于释放介质中，规定时间取出上清液，通过ELISA法测定VEGF水平，绘制出累积释放曲线(图7)。可看出PLGA微球在24 h内没有出现突释效应，在24 h之后VEGF释放量缓慢地增加，1周之后释放速度加快，到21 d进入平台期，到35 d累计释放量接近80%。

图5 两周后微球崩解扫描电镜影像

图6 两周后微球崩解激光共聚焦影像

图7 微球体外累计释放曲线

3 讨 论

本研究所使用的细胞因子VEGF在生理条件下半衰期短，在体内降解速度过快，需要对VEGF进行缓释处理，使其在局部缓慢匀速释放，以达到临床应用的需要[7]。本研究所采用的微球材料为PLGA。PLGA是缓释微球材料，其降解速率适中，性质稳定，具有良好的生物相容性与可降解性，无毒性、无致敏性、无致热性、无致畸致癌作用、无细胞毒性，被广泛应用[8]。

本研究成功制备的亚微米微球粒径约为0.72 μm，观察其药物缓释时间长(30 d左右)，短期时间内未出现药物突释现象。根据文献报道，PLGA制备的微球体积不一，可制备成纳米微球或微米微球，直径由数百纳米至数百微米不等，包裹药物或细胞因子后可使其延长释放达到1～3个月。其中0.5～1.0 μm称为亚微米微球，0.5 μm以下称为纳米微球。体积越小，在缓释时药物分布更均匀，但同等材料下缓释时间会缩短，并且制备难度更大[9]。

复乳溶剂蒸发法是目前制备PLGA微球的常用方法，它不需要相分离剂，操作简单，工艺相对成熟[10]。W/O/W 型复乳可以有效阻碍水溶性药物进入连续相，能够提高药物的包封率。因此，本实验采用 W/O/W 法制备载 VEGF的荧光PLGA 微球。在实验中，多种条件可以影响最终制成的微球粒径，如PLGA浓度、PVA浓度、均质化搅拌速度等。其中提高PLGA 浓度，可以使内水相黏度变大，提高微球载药量与包封率，增大微球的粒径。而当PVA 浓度增加，微球粒径缩小。搅拌速率同样影响较大，速度过低，剪切力小，使成球性差，速度过高会破坏乳液的稳定性，VEGF流失量大[11]。本研究通过参考文献[4，12]以及调整上述试剂浓度[PLGA 40 mg/mL、PVA(8%，W/V)，搅拌速度15 000 r/min]，最终制成粒径为0.72 μm左右的亚微球。

本研究VEGF释放结果表明，微球没有出现突释效应，并且随着时间VEGF逐渐释放，实现了缓释作用。一般情况下，载药微球的释放呈现三相释放模式，即扩散，持续释放以及平台期。Ⅰ相是指黏附于微球表面的细胞因子迅速释放；Ⅱ相是指随着微球的降解，细胞因子逐渐释放；Ⅲ相是指当大部分微球出现崩解，细胞因子释放基本完毕，速度趋于平稳。

因此，本研究制备的PLGA载VEGF亚微米微球，实现了所期望的微球粒径，有较好的包埋率与装载率，并在其中加入了绿色荧光，实现了微球可视，具有较好的研究与应用前景。

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