奶牛临床型乳房炎MRSA新疆流行株耐药基因的检测 及MLST分型研究

孟 丹，孟庆玲，乔 军*，彭叶龙，李重阳，才学鹏，陈创夫

(1.石河子大学 动物科技学院， 新疆 石河子 832003； 2. 阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆 阿克苏 843000；3.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)

奶牛临床型乳房炎是影响奶牛养殖业发展最主要的疾病之一，而金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)又是引起奶牛临床型乳房炎最主要的病原菌之一[1]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是一种引起人类感染的重要病原，它能移居和感染不同动物。由于其流行范围广、感染部位多、多重耐药等已给临床防治带来巨大的困难[2-3]。近年来，随着在畜牧业大量、广泛使用抗菌药物，造成动物源性SA耐药菌株不断增多，多重耐药性严重。动物源性耐药细菌和耐药基因还可以通过食物链传给人类，严重威胁人类的健康[4-6]。金黄色葡萄球菌对抗抗菌药物主要依赖于其自身携带的各种耐药相关基因，由于各抗生素耐药基因所编码的蛋白不同，从而表现出不同的耐药表型[7-8]。

近年来的研究发现，动物源MRSA流行株不断出现，为了明确其传播途径和流行环节，追踪动物源食品中主要污染源以及研究MRSA在人与动物之间的传播机制，对MRSA菌株的耐药表型、耐药基因及分子特征进行监测和分析已成为合理使用抗菌药物的急迫解决的问题。1998年,Maiden等[9]建立了多位点测序分型(multilocussequencetyping，MLST) 技术，该技术以分析管家基因的序列多态性为基础。而多位点序列分型(MLST)具有统一、标准化的全球流行病学资料，适合长期大范围的流行病学研究[10-11]。本研究旨在通过对MRSA新疆流行株耐药表型、耐药基因的检测及MLST分型来分析MRSA流行株的分子流行病学特征，为防控MRSA在人畜间的流行以及指导临床兽医正确使用抗菌药具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Baird-Parker培养基、BHI液体培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；大肠杆菌 (E.coli) DH5α菌种由本实验室保存；细菌基因组DNA提取试剂盒、pMD19-T载体，DNA Marker、均购自TaKaRa公司；生化鉴定管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；抗菌药物纸片购自杭州微生物试剂有限公司；质粒小量提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自诺维森(北京)生物科技有限公司。

1.2 奶牛乳样品的采集

从新疆五家渠、石河子、沙湾、玛纳斯4个地区的规模化奶牛场分别采集临床型乳房炎牛乳样品221份，采集时温水清洗乳房并使用75%酒精棉球对乳头进行消毒处理，收集第3把奶后的奶样放于灭菌的试剂管中，置于冰盒中，运送实验室进行分离培养。

1.3 分离鉴定

将采集的奶牛乳样接种于Baird-Parker培养基，放于37 ℃恒温箱培养12～48 h。挑取具有典型特征的单菌落，在营养琼脂培养基上进行纯化培养。对纯化菌进行涂片、革兰氏染色、镜检。随机选取分离株用SA成套生化鉴定管测定其生化反应特性，根据GenBank中已公布的金黄色葡萄球菌16SrRNA的序列设计通用引物，对SA分离株进行16SrRNA序列比对分析，鉴定分离株为金黄色葡萄球菌。将分离的金黄色葡萄球菌在BHI肉汤中37 ℃培养24 h，再将500 μL所得新鲜菌液加入到500 μL 40%甘油中震荡混合均匀制成20%甘油菌，-20 ℃保存备用。

1.4 药敏试验及MRSA确证方法

用无菌接种环挑取单个菌落，接种于BHI培养液于37 ℃培养20～24 h，再用灭菌生理盐水将细菌浓度调至0.5麦氏浊度，取200 μL均匀涂布于MHA培养基，涂布均匀后贴上14种药敏纸片，用镊子轻压纸片使其与培养基表面紧密接触。放入37 ℃恒温培养箱中培养48 h后测量抑菌圈直径。进一步通过PCR方法扩增mecA来确定MRSA阳性菌。判断30 μg头孢西叮抑菌环直径≤21 mm的菌株即为MRSA。

1.5 耐药基因的检测

采用多重PCR的方法对大环内酯类耐药基因(msrA、msrB)、红霉素类耐药基因(ermA、ermB、ermC)、乙酰基转移酶基因(vatA、vatB、vatC)、氨基糖苷类耐药基因aacA-D、四环素类耐药基因(tetk、tetm)、林可胺类linA进行检测。

1.6 菌株基因组DNA提取

用无菌接种环挑取单个菌落接种至无菌BHI培养液于37 ℃振荡过夜，取1.5 mL细菌培养液于无菌EP管内在12 000 r/min下高速离心，去掉上清液，余下操作步骤按细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明进行。DNA提取结束后，4 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后在凝胶成像系统上照相。DNA模板于-20 ℃保存，用于MLST分型研究。

1.7 多位点序列分型(MLST)

MLST分型研究选择arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil7个看家基因，设计相应的引物进行PCR扩增，用相应的引物对扩增产物进行双向测序，逐一比对每个基因双向测序结果峰图，确认测序质量后将双向测序结果进行拼接，再将待分析测序结果与相应基因的标准序列进行比对并截为标准长度，提交数据库(http://www.mlst.net)获得每株菌株各个位点的等位基因号，并由每株细菌7个看家基因的等位基因号再获得序列号(sequence typing, STs)。

2 结 果

2.1 金黄色葡萄球菌分离鉴定结果

通过Baird-Parker培养基培养，从221株葡萄球菌中检出71株SA，在Baird-Parker培养基上长出灰黑色的菌落见图1。进一步确定通过16SrRNA引物PCR扩增阳性见图2，检出率为32.1%。

图1 SA在Baird-Parker培养基的菌落形态Fig.1 The colony morphology of SA in Baird-Parker

图2 16SrRNA基因的PCR扩增Fig.2 Amplification of 16SrRNA gene by PCRM. Marker 2000； 1-10. Isolates

2.2 MRSA的鉴定及药敏试验结果

71株SA中检出13株MRSA，mecA引物PCR扩增阳性见图3，检出率为18.3%，其中五家渠3株，石河子2株，沙湾4株，玛纳斯4株。13株MRSA对头孢西叮的抑菌环直径均小于21 mm，耐药表型不一，所有MRSA均对青霉素，头孢西叮和甲氧嘧啶显示有耐药表型，此外，有7株表现对红霉素有耐药表型，2株表现对四环素有耐药表型，1株表现对庆大霉素有耐药表型。可见，MRSA主要对青霉素、头孢西叮、甲氧嘧啶、红霉素表现出耐药见表1。

图3 mecA基因的PCR扩增M. Mark2000； 1-3,6-7,11-13,16-17,20-22:PCR产物Fig.3 Amplification of mecA gene by PCRM. DNA Marker DL-2000;1-3,6-7,11-13,16-17,20-22: PCR products

MRSA菌株MRSAstrains耐药表型ResistancephenotypeMRSA菌株MRSAstrains耐药表型ResistancephenotypeSA⁃xj⁃06PEN，CFX，TMPSA⁃xj⁃27PEN，CFX，TMP，EMSA⁃xj⁃08PEN，CFX，TMP，EMSA⁃xj⁃41PEN，CFX，TMP，TETSA⁃xj⁃10PEN，CFX，TMP，EMSA⁃xj⁃42PEN，CFX，TMP，EM，TET，GENSA⁃xj⁃13PEN，CFX，TMP，EMSA⁃xj⁃43PEN，CFX，TMP，EMSA⁃xj⁃14PEN，CFX，TMPSA⁃xj⁃59PEN，CFX，TMPSA⁃xj⁃21PEN，CFX，TMPSA⁃xj⁃61PEN，CFX，TMPSA⁃xj⁃22PEN，CFX，TMP

注:PEN.青霉素;CFX.头孢西叮;TMP.甲氧嘧啶;EM.红霉素;TET.四环素;GEN.庆大霉素;

Note: PEN. penicillin;CFX. Cefoxitin;CLI. clindamycin;TMP. Trimethoprim;EM. erythromycin;TET. tetracycline;GEN. gentamicin;

2.3 MRSA耐药基因检测结果

13株MRSA均被检出耐药基因mecA和linA，其中7株被检出耐药基因tetm，4株被检出耐药基因AacA-Da，4株被检出耐药基因msrB，1株被检出耐药基因VatC，与MSSA相比，MRSA的多重耐药基因的检出率更高见表2。

表2 13株MRSA携带耐药基因结果Table 2 The result of carrying resistance genes of 13 strains of MRSA

2.4 MLST 分型结果

3株MRSA被检出ST188，ST63， ST9 ，ST2700， ST968 ，ST2373，6种MLST分型，其中2株ST188，检出率15.38%，3株ST63，检出率23.08%，3株ST9，检出率23.08%，2株ST2700，检出率15.38%，2株ST968，检出率15.38%，1株ST2373，检出率7.69%(图4)。可见不同MRSA分离株的ST型也有所不同。

3 讨 论

自从20世纪60年代发现MRSA以来，金黄色葡萄球菌(SA)的耐药性呈逐年上升[12]。大量研究已证明，MRSA除了携带mecA基因对β-内酰胺类药物耐药外，同时还携带其他耐药基因，导致对其他抗菌药物的耐药[13-14]。SA具有多种固有耐药基因，同时亦易获得外来耐药基因[15]。有些菌株含有耐药基因中的1～3种，却并没有表现出对药物耐药，说明这些菌株虽然携带耐药基因，但是这些耐药基因并未表达，其在一定条件下可转化为耐药菌株，同时也说明此类菌株不仅具有潜在的耐药特性，并且能够使耐药基因蔓延扩散，因此对这类菌株的耐药性的防治显得尤为突出。现有的研究发现，SA耐药机制极为复杂，同一种抗菌药物的耐药表型常常源于两种或两种以上不同的分子耐药机制共同作用的结果[16]。因此, 针对耐药表型所采用的抗菌药物治疗远没有针对耐药基因的抗菌药物治疗有效。因此，从基因水平进一步深入探索SA的耐药机制具有重要的意义，能够为临床多重耐药的 MRSA 感染选择有效的抗菌药物。

图4 13株MRSA的MLST分型结果Fig.4 The results of MLST genotyping of 13 strains of MRSA

本研究临床乳房炎MRSA样品中，检出了6种耐药基因(mecA、linA、AacA-Da、tetm、msrB、Vatc)，所有MRSA分离株均检出mecA和linA耐药基因，安慧慧等[17]研究中将苯唑西林耐药表型作为判断MRSA的依据。张晓平等[18]研究中将头孢西叮耐药表型作为判断MRSA的依据。本研究大多数MRSA菌株检出多种耐药基因，与耐药表型相比，并不是所有对抗生素有耐药表型的均能检出对应的耐药基因。所检出的耐药基因也不一定均有对应的耐药表型。对于有耐药表型能检测到相应的耐药基因的存在，表明耐药表型与耐药基因的差异性较低，而对于未能检测到相应的基因，表明存在耐药基因的多样性十分复杂，可能是由于基因介导的作用较弱，也可能受环境因素如生长温度，培养时间等的影响，从而干扰纸片法检测的结果。

目前，在MLST数据库中SA可以分成2 840种ST，共收录了4 929株菌株的相关信息，而中国食源性菌株只有91株。经eBURST V3分析显示，中国食源性菌株ST分布存在5个克隆群ST97、ST5、ST398、ST1 和 ST9，最大克隆群为ST97，主要起源克隆群为ST398，在本研究检出的MLST型主要有ST188、ST63、ST9、ST2700、ST968、ST2373，其中ST9和ST63为主要流行株。张怡滨等[19]报道了两株从天津某医院分离的MRSA，属于ST9型，这意味着MRSA ST9型与人类疾病相关。Kehrenberg等[20]人已经从人、猪及与猪接触的工作人员中分离出了ST9型的MRSA菌株，说明ST9能在人与猪之间传播。高红等[21]在宁波市食源性菌株中检出ST188型。由此可见，本研究中检出的ST9和ST188等奶牛临床型乳房炎MRSA分离株与食源性菌株之间存在一定的关联，与人源性菌株之间也有着一定的联系，而食源性菌株与人类日常生活有着密切的联系，因此，奶牛源MRSA在分子水平上存在着向人间传播扩散的潜在风险，因此开展奶牛MRSA流行株耐药表型、耐药基因分布及分子分型研究具有重要的意义。

[1] BELKUM A V, MELLES D C, NOUWEN J, et al. Co-evolutionary aspects of human colonization and infection by Staphylococcus aureus[J]. Infect genet Evol, 2009, 9(1): 32-47.

[3] MAGIORAKOS A P, SRINIVASAN A, CAREY R B, et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance[J]. Clin Microbiol Infect,2012,18(3):268-281.

[4] 王桂琴, 杨萌萌, 邢燕, 等.宁夏地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性分析[J].动物医学进展,2011,32(10):59-62.

[5] 王登峰,李建军,段新华,等.我国牛源金黄色葡萄球菌耐药现状及药敏检测方法探讨[J].中国动物传染病学报,2011,19 (1) :31-38.

[6] ZHANG W, HAO Z, WANG Y, et al. Molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from pet animals and veterinary staff in China[J].The Veterinary Journal, 2011, 190(2):125-129.

[7] MISTRY H, SHARMA P, MAHATO S,et al.Prevalence and Characterization of Oxacillin Susceptible mecA-Positive Clinical Isolates of Staphylococcus aureus Causing Bovine Mastitis in India[J].PLoS One,2016, 11(9):e0162256

[8] TURUTOGLU H, HASOKSUZ M, OZTURK D,et al. Methicillin and aminoglycoside resistance in Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis and sequence analysis of their mecA genes[J].Veterinary research communications, 2009, 33(8): 945-956.

[9] MAIDEN M C J, BYGRAVES J A, FEIL E, et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(6): 3 140-3 145.

[10] FEΒLER A, SCOTT C, KADLEC K, et al. Characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 from cases of bovine mastitis[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2010, 65(4): 619-625.

[11] VANDERHAEGHEN W, CERPENTIER T, ADRIAENSEN C, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ST398 associated with clinical and subclinical mastitis in Belgian cows[J]. Veterinary microbiology, 2010, 144(1): 166-171.

[12] HUANG Y C,SU L H, WU T L, et al. Molecular epidemiology of clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Taiwan[J].Journal of clinical microbiology, 2004, 42(1): 307-310.

[13] 张军民,罗燕萍,张秀菊,等.临床分离金黄色葡萄球菌对20种抗菌药物耐药性及耐药机制分析[J] .中华医院感染学杂志,2003,13(12):1 107-1 109.

[14] KOSMIDIS C, SCHINDLER B D, JACINTO P L, et al. Expression of multidrug resistance efflux pump genes in clinical and environmental isolates of Staphylococcus aureus[J]. International journal of antimicrobial agents, 2012, 40(3): 204-209.

[15] 黄革,周晓红.金黄色葡萄球菌抗菌药物耐药分子机制的研究进展[J].热带医学杂志, 2008, 8(8): 873-876.

[16] ARDIC N, OZYURT M, SAREYYUPOGLU B, et al. Investigation oferythromycin and tetracycline resistance genes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Int J Antimicrob Agents ,2005, 26(3): 213- 218.

[17] 安慧慧.牛源金黄色葡萄球菌耐药性分析及氟喹诺酮类耐药基因检测[D].银川: 宁夏大学, 2014.

[18] 张晓平.金黄色葡萄球菌耐药机制与分子流行病学研究[D].扬州: 扬州大学, 2012.

[19] 张怡滨,宋诗铎,祁伟,等.天津地区4株金黄色葡萄球菌多位点测序分型[J].天津医药, 2004, 32(10): 627-629.

[20] KEHRENBERG C, CUNY C, STROMMENGER B, et al. Methicillin-resistant and-susceptible Staphylococcus aureus strains of clonal lineages ST398 and ST9 from swine carry the multidrug resistance gene cfr[J]. Antimicrobial agents and chemotherapy,2009,53(2): 779-781.

[21] 高红,宋启发,郑剑,等. 2005-2012 年宁波市食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因和多位点序列分型研究[J].中国食品卫生杂志, 2015, 04:345-353.