阿拉善型绒山羊精液稀释液配方的筛选与优化

曲宏伟，吴铁成，何云梅，高 娃，赵存发，李玉荣，刘 斌*，赵生国

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.内蒙古蒙绒绒山羊产业研究院，内蒙古 阿拉善 750306;4.内蒙古鄂尔多斯市鄂托克旗家畜改良工作站，内蒙古 鄂尔多斯016100)

阿拉善型绒山羊是荒漠草原牧区的主要畜种之一，具有适应能力强、羊绒品质好等特点。阿拉善型绒山羊羊绒细度在同类产品中独具优势，但其长期生存在荒漠草原地区，缺乏良好的管理条件，所以生产能力较低[1]。因此，为了提高该种羊的生产能力，增加其经济价值，就需要改进生产方式。人工授精在现代畜牧业的发展中已经起到了重要角色并被大力推广，精液稀释是人工授精的一个重要技术环节，原精经过稀释后，可大幅增加授精母羊的数量，提高种公羊的利用率[2]。目前，在山羊的人工授精技术方面，鲜精配种的效果要显著优于冻精[3]，但鲜精保存的时间都不是很长。所以拥有良好的精液稀释液就显得尤为重要。

精液稀释液需满足精子必须的生存条件，延长精子在体外存活的时间，增强精子活率，从而利于精子的保存和运输[4]。本试验通过对比几种常用稀释液对精液保存效果的差异，筛选出保存效果较好的稀释液配方并进行改进，通过筛选不同pH及不同蔗糖浓度的精液稀释液对精子活率的影响，为精液的保存效果提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用精液采自阿拉善白绒山羊种羊场的3只配种用白绒山羊，年龄均为2岁，身体状况良好。在配种期正常放牧，自由饮水，同时每只公羊每天补饲精料1.2～1.5 kg。

1.2 试验药品及器材

葡萄糖，D-果糖，柠檬酸钠，柠檬酸，EDTA，Tris，青霉素，卵黄，超纯水，蔗糖，电子天平，烧杯，锥形瓶，显微镜，酸度计，移液管。

1.3 试验时间和地点

2016年10月1日至2016年11月10日，在内蒙古某白绒山羊种羊场配种期开展试验。

1.4 稀释液配方

试验初期所采用的4种配种常用精液稀释液配方A1～A4来源于种羊场常用配方及陕北白绒山羊会议记录，其配方成分见表1。经过初次试验后，在所筛选的精液稀释液配方的基础上对其pH进行调整，pH分别为6.7、6.5和6.3，其精液稀释液配方B1～B3见表2。再次试验后，对所得出的最适pH的精液稀释液配方进行改进，改进后的精液稀释液配方C1～C3见表3。在稀释液配制过程中，应先将称量好的药品放入锥形瓶中，再加入100 mL超纯水，最后加入青霉素，所有稀释液需现用现配。

表1 生产上常用的4种精液稀释液配方Table 1 Production of commonly used 4 kinds of semen diluent formula

表2 不同pH的精液稀释液配方Table 2 Different pH of semen diluent formula

表3 改进后的精液稀释液配方Table 3 Improved semen diluent formula

1.5 精液的采集与处理

采用假阴道采集法进行采精。将采到的精液在室温下进行活率检测，然后等量分装于灭菌的离心管内，按照1∶4[2]加入相应的精液稀释液进行稀释，并编号标记，然后将精液置于保温桶内(10～25 ℃)保存。每4～6 h翻动一次离心管，防止精子沉淀。从稀释完精液开始，每6 h进行一次活率检测，直至最后一份精液活率低于0.3为止。

1.6 效果判定

精子活率为视野中直线运动的精子占视野中总精子数的百分比；每次镜检精子活率，随机观察4个视野，检测视野中直线运动的精子数占总精子数的比例，求其平均值作为精子活率；每只羊三次重复。

1.7 数据处理

试验数据用Excel软件进行处理后，采用SPSS 19.0统计软件进行差异显著性分析，结果均以平均值±标准差表示。P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 常用精液稀释液配方的筛选

常用的4种精液稀释液对精子活率的影响结果见表4，试验12 h之前4组精子活率差异不显著(P>0.05)。18h～24 h，A2组与A3组活率显著高于其他两组(P<0.05)。36 h之后，A2组精子活率显著(P<0.05)高于其他三组。

2.2 不同pH对精子活率的影响

不同pH精液稀释液配方筛选结果见表5，试验6 h之前及30 h～42 h之间三组精子活率差异不显著(P>0.05)；在12 h～24 h之间及48 h～60 h之间B3组精子活率显著高于其他两组(P<0.05)。

表4 不同稀释液对精子活率的影响Table 4 Effects of different semen dilutions on sperm motility

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不标或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同。

Note: Different letters in the same row indicate significant differences (P<0.05), no letter or the same letter indicate insignificant difference(P>0.05). The same below.

表5 不同pH对精子活率的影响Table 5 Effects of different pH on sperm motility

2.3 改进后的精液稀释液对精子活率的影响

从表6可以看出，6 h之前三组精子活率差异不显著(P>0.05)；12 h～72 h之间C2组和C3组精子活率显著高于C1组(P<0.05)；而C2组和C3组之间差异不显著(P>0.05)。

2.4 三组配方中最优组精子活率对比

在图1中，通过将三种精液稀释液各组中最优的一种配方效果进行比较可见，虽然短时间内各稀释液之间精子活率差异不明显，但随时间延长，优化后的精液稀释液中精子的活率及存活时间已明显超过原精液稀释液。

图1 三组配方中最优组精子活率对比Fig.1 Comparison of sperm motility in optimal group of 3 groups

保存时间/hStoragetime稀释液SemendiluentC1C2C300．85±0．050．84±0．070．83±0．0760．81±0．070．84±0．070．83±0．06120．74b±0．050．81a±0．070．81a±0．05180．71b±0．050．80a±0．060．78a±0．06240．69b±0．050．78a±0．060．76a±0．07300．65b±0．050．74a±0．050．73a±0．07360．63b±0．080．72a±0．060．70a±0．07420．57b±0．090．68a±0．060．69a±0．08480．53b±0．080．68a±0．070．67a±0．10540．51b±0．070．64a±0．070．65a±0．09600．48b±0．060．63a±0．070．63a±0．08660．44b±0．080．58a±0．060．57a±0．07720．40b±0．070．52a±0．070．50a±0．07780．28±0．100．33±0．080．33±0．06840．09±0．140．11±0．160．09±0．14

3 讨 论

精子活率是评价稀释液效果的重要指标，是保证精子通过雌性生殖道并使卵子受精的重要条件[5]，本次试验根据精子活率的情况，对四种不同的常用精液稀释液效果进行评定，可以看出A2组稀释液的效果明显要优于其他各组稀释液(P<0.05)。而将这四组常用稀释液进行pH测定后发现A2组的pH为6.5，其他三组分别为6.8，7.0，7.4，可以看出A2的pH相比其他三组偏酸性，从而以A2组稀释液为基础，对其配方成份进行pH优化改进。

新鲜精液的pH一般为中性偏碱，当pH低于这个范围时，精子的活动及新陈代谢都会降低。大多数精液稀释液中高浓度的葡萄糖能使pH降至6.0以下，这种酸性环境可以延长精子的体外保存时间[6]。但是稀释液中的pH超出一定的酸度范围，则容易引起精子死亡，所以稀释液中需添加适量的缓冲剂来调节pH[7]。而将EDTA作为缓冲剂加入稀释液中，也有利于精子的保存[8]。在本次试验中，通过调节精液稀释液的pH来观察不同pH对精子活率的影响，发现pH为6.3的B3组的精子活率要优于其他两组(P<0.05)，所以可以看出偏酸性的外界环境更容易保持精子活率及延长山羊精子的存活时间，然后再以B3组稀释液为基础，再进行进一步的改进。

糖类是精液稀释液中的重要成分，精子主要通过糖酵解途径产生能量来维持细胞的新陈代谢及鞭毛运动，这些能量主要是由稀释液中的葡萄糖提供[9]。并且糖类还能够在细胞的亲水组织中替代水分子，这一特性在温度变化过程中保护细胞膜起到重要作用[10]。研究表明，高浓度的葡萄糖能够提高精子活率，但是高浓度的蔗糖等双糖对精子活率的提高也有作用[11]。本试验中，采用在筛选出的稀释液中添加蔗糖对精液稀释液进行改进，其效果要优于之前的稀释液，尤其是蔗糖浓度为12 mg/mL和18 mg/mL的C2组和C3组，精子存活时间及精子活率均大于原稀释液。有研究显示，虽然蔗糖单独添加于稀释液对精子的保存效果较差，但与其他糖类混合后对于精子的保存效果要优于未混合组[12]，这与本次试验所得出的结论相同。因本次试验条件有限，只添加了蔗糖一种糖类进行改进，若在稀释液中再添加海藻糖等其他糖类，效果可能会更好，这有待进一步试验验证。

本次试验结果与其他相关试验[3，13]相比，精子的保存时间及活率也有了较高的提升。为在草原牧场上更加高效的利用优质种公羊，提高精子活率和延长精子保存时间是非常必要的。这对于草原上距离较远的羊场之间进行人工授精提供了很大的方便，既不需要冷冻精液复杂的设备，又保障了所提供精子的活率。

4 结 论

本试验结果表明，阿拉善型白绒山羊精液稀释液的最佳pH为6.3，最优蔗糖浓度为12～18 mg/mL。最优配方为：葡萄糖3.00 g、柠檬酸钠1.40 g、EDTA0.12 g、蔗糖1.8 g、青霉素20万U、卵黄10 mL，超纯水100 mL。本次试验所在地处于偏远地区，试验条件及设备有限，对精子的保存产生不利影响。但是从试验的整体效果来看，已经起到了改进常规精液稀释液的目的，这将有利于阿拉善牧区绒山羊的人工授精及种公羊的利用率，对于较远距离羊场之间精液的运输和人工授精提供了可靠保障。

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