2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯高效液相色谱定量分析方法的建立

孔英戈，汪 华，张少云，潘 萍

（衡阳市食品药品检验检测中心，湖南 衡阳 421001）

巴氯芬（baclofen，氯苯氨丁酸）为解痉药，是γ-氨基丁酸（GABA）的衍生物，为作用于中枢神经系统脑和脊髓的骨骼肌松弛剂、镇静剂[1]。巴氯芬是第一个应用于临床的选择性GABAB受体激动剂，曾作为肌松药用于临床，近年来又发现了许多新的应用，如镇咳、抗癫痫、治疗顽固性呃逆、中风及脊髓损伤引起的疼痛、三叉神经痛等。在脑血管病康复期，应用巴氯芬也取得良好效果，采用巴氯芬治疗胃食管反流病开辟了非抑胃酸治疗胃食管反流病的新途径[2]。巴氯芬的结构式为：

2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯是合成巴氯芬的关键中间体[3]，其含量和稳定性直接决定最终产物巴氯芬的质量和产量，而目前未见该中间体相关分析方法的报道。因此，研究巴氯芬关键中间体2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的定量分析检测方法是非常必要和重要的。2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的结构式为：

高效液相色谱法（HPLC）是色谱分析法的一个分支，是近年来药物分析中发展较快，已占主导地位的分离、分析方法[4-7]。其特点是分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、适用范围广、组分易回收等，现已广泛应用于药物成分含量测定、组成分析和质量控制等方面[8]。本研究采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC），利用二极管阵列检测器（DAD）定量检测分析巴氯芬的关键中间体2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦1260 Infinity四元液相色谱系统，包括1260 Quat pump（四元低压混合泵）、在线真空脱气机、1260 ALS自动液体进样器、1260 TCC柱温箱和1260DAD全波长扫描检测器；全玻璃溶剂过滤器AUTO SCIENCE。

甲醇：色谱纯（HPLC级），经0.2 μm孔径油相滤膜过滤处理；水：实验室二级纯水，经0.2 μm孔径水相滤膜过滤处理；2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯标准品（纯度大于99.0%）。

1.2 色谱条件

色谱柱：WAT054275 Waters Symmetry（ 250 mm×4.6 mm，5 μm）不锈钢柱，内装C18（5μm）键合固定相；流动相：甲醇-水（70+30）；紫外检测波长：319 nm；柱温：40.0℃；流量：1 mL/min；进样量：20.0 μL；典型保留时间：7.5 min。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱柱的选择

为实现目标化合物的有效分离与测定，满足检测重现性要求，比较和选择适宜目标化合物的色谱柱。试验选择比较了WAT054275 Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SB（Stable Bond） C18色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、XDB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、岛津C18色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色谱柱。结果发现，WAT054275 Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 分 离峰 对 称性 较好，重现性较优异。本工作选择WAT054275 Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为分离分析柱。

1.3.2 标准溶液的制备

2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯标准溶液的配制：称取约0.05 g（准确到0.000 2 g）2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯标准样品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超声处理后，待样品完全溶解并冷却至室温后用甲醇定容。摇匀后，用移液管准确移取1.0 mL溶液于另一只25 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，振荡摇匀。用0.45 μm滤膜过滤备用。

1.3.3 试样溶液的配制

试样溶液的配制：称取约0.05 g（准确到0.000 2 g）2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯待测样品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超声处理后，待样品完全溶解并冷却至室温后用甲醇定容。摇匀后，用移液管准确移取1.0 mL溶液于另一只25 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，振荡摇匀。用0.45 μm滤膜过滤备用。

在上述条件下，待仪器状态稳定后，连续注入几针标样溶液，计算各针相应值的重复性，待相邻两针的相对响应值变化小于0.5%以后，按标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液顺序进行色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按色谱条件对样品溶液及标准溶液进行测定，其色谱图如图1所示。

图1 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的液相色谱图

2.2 检测波长的选择

经190～590 nm全波段扫描，2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯在200～250 nm范围内都有较强的紫外吸收（见图2），在319 nm左右处吸收最强且此时杂质和主峰吸收均较理想。因此，选择319 nm为其检测波长。

2.3 流动相的选择

试验发现，2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯在流动相甲醇-水（30:70）时，保留时间较短，甲醇-水（5:95）时，保留时间长，分离效果较差；在比例为（10:90）时能6 min内出峰，但分离效果和峰形不好。在甲醇-水（70:30）时，无论是保留时间、分离效果还是峰形都比较好。因此，试验选择甲醇-水为流动相，流动相比为（70:30）。

图2 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的紫外扫描光谱图

2.4 方法的线性范围

按照1.3.2称取0.05 g标准品配制成溶液后分别用移液管准确移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容并摇匀过滤。在1.2色谱条件下测定，其结果如表1所示。

表1 线性关系的测定结果

根据表1结果绘制线性回归曲线，如图3所示。线性方程为y=106x+252 987，相关系数r2=0.999 5，从中可看出方法的线性范围较宽。

图3 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯标准曲线

2.5 精密度的测定

用同一样品在色谱条件下进行多次重复测定，结果如表2所示。表2结果说明，该方法的精密度较好。

2.6 回收率的测定

将2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯标准样品加入已知2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯含量的样品中，在色谱条件下测定其回收率，结果如表3所示。

从表3可知，回收率在98.6%～100.8%，说明方法的准确性很好。综合以上试验结果，采用高效液相色谱法，能够满足对2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的定量分析要求。

表2 精密度的测定结果

表3 回收率的测定结果

3 结论

本文采用高效液相色谱法建立了2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的外标法定量分析方法。该方法利用WAT054275 Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-水（70:30），流速1 mL/min，使用二极管阵列检测器于319 nm测定，并且样品杂质不干扰测定。这种方法的标准偏差为0.34%，变异系数为0.35%，线性范围较宽，相关系数为0.999 7，样品加标回收率为98.6%～100.8%，定量分析检测结果满意。

1 谢瑞满.巴氯芬临床应用研究进展[J].世界临床药物，2006，（3）：149-153.

2 汪萌芽，朱 蓉.解痉药巴氯芬研究进展[J].中国药理学通报，1992，（5）：335-339.

3 端振英.R（-）-巴氯芬的合成及中间体（±）-GAM的拆分[D].河北：河北医科大学，2003.

4 成都科学技术大学分析化学教研室.分析化学手册（第四册下册 光谱分析）[M].北京：化学工业出版社，1984.

5 The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopoeia X XⅢ[S].Washington，DC：The United States Pharmacopeial Convention，2012.

6 British Pharmacopoeia Commission.British Phavmacopia[S].London：British Pharmacopoeia Commission，2002.

7 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

8 竹叶晋，张 杰.HPLC-EISD在药物分析中的应用进展[J].赣南师范学院学报，2003，12（6）：39-41.