IL-8在子痫前期患者血清及胎盘中的表达及意义

郝彦兰 毛东伟 郭瑞军 郝秋亚

子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠期妇女特有疾病，也是造成孕产妇和围生儿发病和死亡的主要原因之一，严重威胁母婴健康[1]，其但病因及发病机制尚未明确。近年来随着研究的深入发现，细胞因子作为重要的炎症介质和免疫调节因子在子痫前期的发生发展中起着越来越广泛的生物学作用[2]。Sharma等研究表明白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 作为炎症与内皮细胞损伤标志与妊娠期高血压疾病的关系密切相关[3-4]，另有研究也发现IL-8及C-反应蛋白(C-reactive protein ，CRP)的表达水平在子痫前期孕妇中明显升高[5]。这些研究的发现为IL-8在胎盘血管病的炎性应答中所起的作用提供了很好的依据。本研究通过检测白介素-8在子痫前期患者血清及胎盘组织中的表达情况，探讨其与子痫前期的发生、发展及疾病的严重程度的关系。

对象与方法

1.对象：选取于2014年10月—2015年12月，在我院产科分娩的子痫前期患者，孕妇年龄约在20～42岁，平均(29.3±3.7)岁。孕周34～40周，平均(37.2±3.2)周。并根据病情分为子痫前期组(轻度20例、重度40例)，选择无并发症足月妊娠的孕妇20例为正常妊娠组，孕妇年龄18～36岁，平均(28.15±3.2)岁；孕周37～41周，平均(38.5±1.0)周，各组孕妇年龄以及分娩时孕周比较差异均无统计学意义(P>0.05)。所有孕妇既往均无心、肝、肾疾病及高血压病史，无其他产科并发症，均以社会因素剖宫产终止妊娠。子痫前期的诊断标准及分类按照谢幸主编的第8版《妇产科学》[6]。

2.标本处理和检测

(1)标本的获取及储存：子痫前期组在未治疗前及正常妊娠组产前均抽取静脉血3 mL,静置30 min，以 3000 r/min离心10 min,分离血清，-80 ℃保存待测。

(2)血清IL-8检测：采用 ELISA法测定，试剂盒购自上海博士德生物科技公司，严格按照说明书进行相关实验。

(3)胎盘取材：分娩后取胎盘组织1 cm(应避免钙化及出血区)，用生理盐水冲洗后，用中性甲醛固定48小时，然后脱水包埋。

(4)胎盘中IL-8检测：取各组组织切片,用免疫组织化学的方法分别对IL-8表达进行检测。 将包埋的石蜡切片经脱蜡、脱苯、水化后进行柠檬酸钠缓冲液修复抗原，滴3%H2O2甲醇溶液灭活酶，10%正常山羊血清室温封闭，滴加1：200稀释IL-8一抗，37℃温盒孵育2小时。PBS洗掉后分别滴加通用型IgG/HRP二抗，37℃温盒孵育30分钟，即用DAB显色，加DAB显色液，光镜下观察3～8分钟，自来水冲洗，然后，苏木素复染，自来水冲洗；酒精梯度脱水，二甲苯脱酒精后，封片镜检。结果判定：①按阳性细胞率评分：阳性细胞数占11%～50%为2分；51%～80%为3分；>80%为4分。②按显色程度评分：染色弱1分；中等染色2分；强染色3分。将两种评分标准结合起来分为3级：无论染色强度如何，细胞阳性率<10%为阴性(-)；评分3～5为弱阳性(+)；评分6～7分为强阳性(++)。

结果

1.各组血清中IL-8水平：结果提示IL-8在子痫前期重度组的表达明显高于正常妊娠组(t=3.48,P<0.01)，而轻度子痫前期组的表达低于重度子痫前期组(t=2.03 ,P<0.05)，由结果推测，子痫前期患者血清中IL-8的浓度明显升高，且随着疾病的严重程度增加其含量也增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：P<0.01，CON为正常对照组，M-PE为子痫前期轻度，S-PE为子痫前期重度图1 子痫前期患者与正常对照组血清中IL-8浓度的比较

2.各组胎盘组织中IL-8的表达：免疫组化方法检测胎盘组织中IL-8的表达结果显示胎盘组织中均可见IL-8表达,主要表达于细胞质上皮细胞，腺上皮，细胞间质血管内皮细胞和血管周围间质细胞中。各组IL-8在胎盘组织检测结果如图2所示(图中棕色颗粒为IL-8的阳性表达)，IL-8在轻度子痫前期患者组及重度子痫前期患者组中的阳性表达率分别为80%、87.5%；而在正常对照组中阳性表达率仅有35%。两组患者与正常对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，而轻度子痫前期组与重度子痫前期组差异不显著(P=0.701)，见表1。

表1 各组胎盘组织切片中IL-8表达的比较n(%)

注:*与对照组比，P<0.05

讨论

子痫前期是妊娠期特有的疾病之一，占整个妊娠的3～5%，临床以血压升高和蛋白尿为主要表现，随着病情的进展可引起全身多器官损害、抽搐、脑出血、凝血功能障碍、HELLP综合症、昏迷等症状，可导致胎儿窘迫、胎儿宫内生长受限、羊水过少、早产等[1]，虽然对子痫前期的研究不断增多，但其病因及发病机制仍未明确，随着PE的发病率逐步升高及对母婴越来越严重的影响，对于子痫前期的病因及发病机制的研究仍是目前探究的难题。

子痫前期的基本病理生理变化是血管内皮细胞损伤导致全身小血管痉挛、全身器官血流灌注锐减、局部缺血缺氧等病理变化并发生氧化应激反应[7],而且很多致病因素都与血管内皮细胞的损伤有关[2]，多数研究者认为血管内皮细胞损伤可能与母体循环中的过度炎症反应和自由基增高及单核细胞、粒细胞的激活有关。随着研究的不断深入，越来越多的实验证据表明血管内广泛的过度炎症反应导致的内皮细胞损伤是子痫前期的病理基础，而内皮细胞在炎症过程中可以产生多种致炎性细胞因子，这些细胞因子之间通过复杂的网络体系，产生级联放大反应，共同促进炎症反应，对机体产生一定损伤。IL-8属于CXC类趋化因子，与中性粒细胞上的受体结合后，通过Rho和Rac激酶信号通路增强平滑肌细胞收缩，在高血压的发生和发展中起着非常重要的作用[8]。而且国外有报道子痫前期孕妇血清中IL-8的表达增高[5]，提示IL-8的高表达可能与子痫前期血压升高有关。

IL-8是1987年由Yoshimura[9]首次发现，其基因定位于4号染色体的q12-21，全长5191 bp，由4个外显子和3个内含子组成[10]。IL-8在体内具有广泛的生物活性，可由多种细胞产生，其生物学功能都是由IL-8受体介导的，IL-8主要趋化调节中性粒细胞、T细胞及嗜碱性细胞，通过细胞的趋化作用，导致组织细胞浸润，在免疫和炎症反应中起重要作用，与部分肿瘤和妊娠合并症(如早产、胎膜早破)的发生和发展也密切相关[11-12]。既往实验显示高血压患者中内皮细胞表达IL-8增加[13]；也有研究显示高血压患者随着治疗，血压下降时其血清中IL-8的表达水平也随之下降[14]，从而说明IL-8在高血压的发生、发展中起着很重要的作用。根据既往的研究资料[8,13]，IL-8引起血压升高的机理可能如下：一方面促进中性粒细胞与内皮细胞表达受体结合，从而损伤内皮细胞，使血压升高，另一方面可使钙离子内流，增加细胞内钙离子的含量，平滑肌收缩加强，血管阻力增加，血压升高。有研究指出胎盘缺血缺氧是导致内皮细胞激活和损伤的主要原因，而缺血缺氧又进一步增加炎症性细胞因子的表达，炎性因子表达增加又进一步增加内皮细胞的通透性进一步加重内皮细胞的损伤，而内皮细胞损伤和功能障碍也可以引起胎盘缺血缺氧，反复的恶性循环，最终导致疾病的更深一步的发展[15]。而子痫前期患者显著的临床特征为血压升高，故IL-8可能通过上述作用使子痫前期患者血压升高，而血压升高进一步引起炎症、内皮细胞损伤、局部缺血等反应，形成恶性循环，引起全身血管痉挛缺血，进而出现一系列子痫前期或子痫的临床症状。

Moreno-Eytimio等研究发现重度子痫前期患者血清中炎性因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达明显高于轻度子痫前期和血压正常的孕妇组，且三个指标中IL-8的变化尤为明显[16]，这与本实验结果一致，在子痫前期组患者血清中IL-8的表达明显高于健康组患者(P<0.01)，且随着病情加重其表达水平也增高，然而在研究CRP、IL-8、IL-6、IL-10等炎症性因子引起的早产的实验中，早产组孕妇血清对IL-8表达的比较没有发现显著的差异，进一步说明IL-8在子痫前期患者中的高表达具有一定的特异性[17]。胎盘作为母儿物质交换的器官，在胎儿生长发育过程中起着重要作用，正常情况下，胎盘中存在大量的细胞因子，在细胞的生长分化、免疫调节及炎症的发生有重要作用，而本实验通过免疫组化的方法检测胎盘中IL-8的表达显示，IL-8在子痫前期轻度和重度孕妇胎盘中表达的阳性率分别80%、87.5%；而在正常对照组中阳性表达率仅有35%，而且随着胎盘娩出后孕妇有关子痫前期的临床症状逐渐消失，因此推测子痫前期的发生与子宫和胎儿关系不大，子痫前期患者的胎盘可能是炎症性细胞因子IL-8的来源；此外IL-8的强阳性表达在子痫前期轻度和重度患者分别为45%和60%，总的来说，IL-8在胎盘中的表达与子痫前期严重程度呈正相关。本实验结果表明IL-8在子痫前期患者中的表达明显增高，而且在胎盘及血清中水平变化有一定相关性，推测IL-8在子痫前期的发生发展中起重要作用，但具体作用机制尚未能明确。因此，进一步研究IL-8分子基因水平上的作用机制以及胎盘在产生IL-8等炎性细胞因子的过程中的作用，更好地了解胎盘产生炎性因子的具体通径，使IL-8成为子痫前期临床检测指标，通过检测IL-8的水平及减少其释放，可能成为预防和治疗子痫前期的新路径。

(图2)

1 Mol B W,Roberts C T,Thangaratinam S,et al.Pre-eclampsia.Lancet,2016,42:58-61.

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16 Morenoeutimio M A,Vargasavila K,Nietovelázquez N G,et al.Increased Serum Levels of Inflammatory Mediators and Low Frequency of Regulatory T Cells in the Peripheral Blood of Preeclamptic Mexican Women.Biomed Res Int.2014,413249.

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