水环境中贾第鞭毛虫和隐孢子虫检测方法的研究进展

张泽清

（太原供水集团有限公司水质监测中心，山西太原030009）

随着我国经济的不断增长和人民生活水平的不断提高，人们对饮用水的卫生状况越来越注重。病原微生物是威胁水环境卫生状况的一个非常大的因素，贾第鞭毛虫和隐孢子虫则是其中的典型代表，其危害一直受到国际社会的关注和重视。两虫在感染人体后具有潜伏期长、个体小、致病率高等特点，当两虫感染人类后，常使患者人体出现发烧、腹泻等症状，甚至会导致患者的死亡。通过优化水处理工艺可以起到一定的去除效果，但由于其对传统的氯消毒剂有较强的抗性，在水环境中存活时间长，因此并不能将其完全消除[1]。只有加强实时监测，根据监测结果采取针对性的措施，才能有效降低两虫的危害。

1 贾第鞭毛虫和隐孢子虫的危害

两虫广泛寄居在大自然的各类水体中，其虫卵可以长期存在于水体中，人一旦饮用被两虫污染的水，就极有可能发病。两虫主要来自于养殖场、农场和屠宰场，通过排放的受污染水，来对其他水环境造成污染。

贾第鞭毛虫主要寄生在人体的肠道系统内，儿童、老人、体弱多病人员是极易感染者。当人体感染该病原体后，会在人体内繁殖出孢囊，可以随人体的排泄过程而排出体外，并可能再次进入到水环境中。它们可以在水环境中存活较长的时间，当温度适宜时，可以在水环境中存活超过3个月，并随着人类饮用受到污染的水，而再次进入到人体。

隐孢子虫属于一种细胞内的寄生虫，人畜皆可患病，其传播途径较为广泛，当人接触到受污染的水源、食物、动物后，就有可能患上该病，它们还能以卵囊的形式被排出到体外，如果被排放进饮用水源内，就有可能造成人类的循环感染。该虫卵进入到水体后，虽然不能进行自我复制和繁殖，但对绝大多数的消毒剂都有免疫效果，且可以在水环境中存活很长的时间，有些虫卵可以存活1年以上。

2 贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测方法研究

美国是最先开始进行两虫检测的，其首先发明了硫酸锌-罗果氏法，后经过多代研究技术人员的努力，检测方法越来越多，其中较为先进的检测方法有ICR法、EPA1623法、聚合酶链式反应法、反转录PCR法、嵌套PCR法和荧光杂交法等。其中免疫荧光法的应用最为广泛，目前成为国际上通用的两虫检测方法[2-4]。

ICR法是应用最早的一种两虫检测方法，又称为梯度分离法。蔗糖漂浮法和福尔马林-乙酸乙酯法主要利用了各种组分比重不同的原理，从而实现了对孢囊和卵囊的分离和回收。但这种方法在实际应用过程中，易被多种因素所干扰，从而导致该方法检测结果准确性较低。

隐孢子虫免疫分离法产生于美国，并取得了不错的发展，后来将其应用到贾第鞭毛虫的检测中，便形成了现在的EPA1623方法。其应用的主要原理是带有两虫抗体的磁珠可以专一地和两虫发生反应，并形成两虫和磁珠的复合物，在经过特殊处理的磁场中，可以有效地分离和提纯该复合物。在酸性溶液中，可以重新将两虫和磁珠分离，然后对其荧光染色，最后通过显微镜计数。

碳酸钙沉淀浓集法也是常用的两虫检测方法，先在水样中加入氯化钙和碳酸钠，并通过添加氢氧化钠将溶液pH值提高到10左右，这时碳酸钙会结晶，其结晶大小和虫卵囊相近，并会产生沉淀现象，通过对沉淀物的收集，并加硫酸后的离心浓缩，最后对其进行染色检测。

在以上三种方法中，ICR和免疫磁分离法比较成熟，目前免疫磁分离法发展较为迅速，且很好地克服了ICR法所存在的不足，因此在实际检测中，EPA1623法被越来越广泛地应用，笔者将在下文中简要介绍其实际检测中的关键步骤。

2.1 EPA1623免疫磁分离法的关键步骤

由于实际水环境中的两虫数量较少，因此在得到水样本后，需选择1μm的滤囊过滤水样，将其紧密连接到采样接口处，并保证在加压后不会脱开。在过滤过程中，将泵流量控制在2 L/min，在采集到足够的水样后，立即关闭蠕动泵。

在滤囊使用完毕后，及时将滤囊放空，并尽量排空滤囊中的水分，一定要尽量保证水从下口排出。在排水完毕后，淘洗滤囊，在淘洗过程中，将摇臂的摆角控制在90°左右，充分将包囊和卵囊从滤囊上分离下来。

将采集得到的过滤液放入到锥形离心管内，并进行1 500 g的离心分离，在离心完成后，小心移除上清液，此过程一定要小心谨慎，避免将溶液弄混。如果所得的沉淀物小于或等于0.5mL，可一次将其转移到侧平面管中，如果体积超过0.5mL，需要分次转移，保证每次转移的量不超过0.5mL，在转移完毕后，做好对沉淀物的标记。

先将Buffer-A溶液和Buffer-B溶液各1mL加入到侧平面管，再加入离心溶液加入，并将两次润洗离心管后液体也一并转入，然后分别加入DynabeadsGiardia-Combo和DyanabeadsCrypto-Combo各100μL。将上述混合液放在25 r/min的搅拌器上旋转1 h后，再将其放入到磁浓缩器MPC-1中90°旋动2 min，倒出上清液后，再加入1 mLBuffer-A溶液，随后轻柔地将其转移到1.5mL的离心管内，再放入另一个磁粒子浓缩器MPC-M中，摇动1 min后，吸出上清液，随之对溶液加酸酸化，并放置在载玻片上，采用二次酸化的方法，来提高其回收率。

此时应该进行对样本的染色工作。先在样本上滴一滴甲醇，并在干燥后，加入荧光染色液，静置30 min后，再加入DAPI染色剂，2 min后清洗，然后加入一滴固剂封片。

按一定的顺序在镜片上进行扫读，此时，就可以利用荧光反应、DAPI染色特性、DIC观测镜片。在蓝光激发下，贾地鞭毛虫孢囊会呈现带明亮苹果绿色的椭圆形，在紫外光下，孢囊内部还会呈现出蓝色的核。还可以通过DIC观察到刺突、柄、附属物等典型结构。隐孢子虫的卵囊在蓝光荧光的激发下，则呈现出明亮苹果绿的微椭圆的圆形，在紫外光下，卵囊还会呈现出蓝色的核。

在试验过程中，要严格控制各种检测工艺的时间，并做好试验的防护工作，防止受到病原体的感染。

3 结语

随着人们生活水平的不断提升，人们对饮水的卫生情况提出了更高的要求。贾第鞭毛虫和隐孢子虫在进入到人体后，会对人体健康产生很大的威胁，因此对其防范工作十分重要。为了对两虫进行有效的防范，必须做好水环境中的检测工作。目前对两虫的检测方法较多，其中免疫磁分离法发展较快，并取得了不错的应用效果。但该方法的操作较为复杂，想要得到更准确、更高效的试验结果，还需要检测人员不断提高自己的检测技能。

[1]崔福义,左金龙,赵志伟,等.饮用水中贾地鞭毛虫和隐孢子虫研究进展[J].哈尔滨工业大学学报,2006,38(9):1487-1491.

[2]张致一,李闻,于凌琪,等.天津和沈阳末梢水中贾地鞭毛虫和隐孢子虫调查[J].环境与健康杂志,2009,26(1):52-53.

[3]韩范,谭渭仙,周性兰.南京地区人体隐孢子虫病2例报告[J].江苏医药,1987(13):692.

[4]邓明俊,肖西志,孙涛,等.蓝氏贾地鞭毛虫检测技术研究进展[J].动物医学进展,2012,33(12):168-173.