越橘品种‘Koralle’茎尖繁殖体系建立1)
2018-03-27李艳霞刘忠玲刘建明李桂君
李艳霞 刘忠玲 刘建明 李桂君
(黑龙江省林业科学研究所,哈尔滨,150081)
组织培养以其培养周期短,繁殖系数高等优点,成为快速繁殖优良苗木的实用技术,已被广泛应用于农、林业等领域[1-4]。而茎尖培养技术是培育无病毒植株、种质资源保存、育种以及遗传转化等研究的有效手段[5-7]。研究表明,影响植物茎尖培养的有关因子主要有树种和品种[8]、取材及接种时期[9]、外植体的消毒[10]、培养基、激素[11-13]以及培养条件等。
越橘(Vacciniumvitis-idaeaL.)为杜鹃花科越橘属小灌木,是近年来新兴的小浆果树种,目前世界上已有众多的栽培种用于鲜果的生产。科利尔‘Koralle’是从越橘野生群体中选出的栽培种,果实为亮红色,酸甜可口,具有抗氧化、抗衰老、抗溃疡、抗炎和抗瘤等生理功能及药用价值[14]。植株矮化性能好,四季常绿,具有耐瘠薄、耐风、抗旱、耐寒性强等优点,是难得的、十分珍贵的园林绿化植物资源。李亚东等[15]对‘Koralle’光合作用特性进行了研究。吴林等[16]对‘Koralle’的叶片组织细胞结构进行了观察、描述,并测定了叶片、栅栏组织及海绵组织厚度等结构参数。在组织培养过程中,pH值高低都会影响‘Koralle’的腋芽增殖[17]。尽管国内外积累了一些有关‘Koralle’的研究资料,但迄今为止,尚未见其茎尖快繁的研究报道。因此,本研究以‘Koralle’为试验材料,在不同生长期进行取材,对影响茎尖诱导的主要因子进行研究,旨在建立其茎尖离体快繁技术,为获得大量优良苗木提供基础。
1 材料与方法
试验材料为越橘优良品种‘Koralle’,该品种是从白俄罗斯引进,露地栽培于黑龙江省森林植物园基因保存区。
取材及消毒处理:分以下几个时期进行取材试验,即取休眠期枝条于温室内水培催芽,灭菌后接种;取新梢生长初期枝条的顶端新萌发嫩芽,灭菌后接种;取新梢生长中期的顶端嫩枝茎尖,灭菌后接种;取盛花期的枝条顶端茎尖,灭菌后接种;取秋季休眠前的枝条顶端茎尖,灭菌后接种。
取嫩芽放入组培瓶中,滴2滴洗洁精,在自来水下冲洗30 min。在超净工作台上,用75%的乙醇溶液消毒(30、40、50 s),再用无菌水冲洗2次,转到0.1%升汞(2、4、6 min)中灭菌处理,无菌水冲洗2次,再用2%次氯酸钠溶液处理(1、2、3 min),无菌水冲洗4次,最后用无菌滤纸吸干表面水分备用。按照正交表L9(34)设计成9种不同的处理。将1 cm长茎尖接种到改良的WPM(分别用708 mg·L-1的Ca(NO3)2·4H2O、202 mg·L-1的KNO3代替WPM培养基中的CaCl2和K2SO4)培养基上,每个处理接种6瓶,每瓶5个茎尖,重复3次。蔗糖20 g·L-1,琼脂6 g·L-1,pH值5.4,培养温度为(23±2)℃,光周期为14 h·d-1,光照强度为2 200 lx,以下组培试验条件均与此相同。接种1周后统计污染率。
培养基、激素对茎尖增殖的影响:分别以MS、WPM、改良的WPM为基本培养基,培养基中分别添加ZT(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)和GA3(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)。按照正交表L9(34)设计成9种不同的处理,将茎尖接种到培养基上,30 d后调查其增殖倍数和生长情况。
生根、移栽培养:取继代培养2次的健壮试管苗在温室中炼苗,3~4 d后成簇取出(带有愈伤组织),用清水冲洗基部,去除培养基。在质量分数为800 μg·g-1的IBA中浸泡3 min,用消毒的水苔包裹苗,仅露出1/3~1/4顶部,栽到草炭和蛭石基质的营养钵诱导生根,用透光的塑料薄膜拱棚保温保湿,相对湿度控制在85%左右,温度控制在25 ℃,诱导生根,40 d调查生根率。
数据统计分析:按下列方法统计茎尖离体培养污染率、成活率、增殖系数以及生根率,采用SPSS21.0软件进行方差分析和多重比较。
茎尖污染率=(污染茎尖数/接种茎尖数)×100%;
茎尖成活率=(茎尖成活数/接种茎尖数)×100%;
增殖系数=增殖后的不定芽数/接种茎尖数;
生根率=(生根苗数/移栽苗数)×100%。
2 结果与分析
2.1 取材时期对茎尖诱导的影响
由表1可见,从休眠期枝条于温室内水培时期到秋季休眠前期,茎尖污染率呈升高趋势,而茎尖诱导成活率呈下降趋势。休眠期枝条于温室内水培时期与其他时期相比有一定差异,茎尖污染率较低,为7.42%,茎尖诱导成活率较高,为84.01%。新梢生长初期茎尖污染率高于休眠期枝条于温室内水培时期,茎尖诱导成活率与休眠期枝条于温室内水培时期无显著差异,与盛花期、秋季休眠前期差异显著。新梢生长中期茎尖污染率达到50.81%,成活率为45.15%。盛花期和秋季休眠前期茎尖污染率较高,分别为87.90%和92.60%,茎尖诱导成活率较低,分别为10.12%和5.22%。由此可见,不同取材时期茎尖污染率和诱导成活率有很大的差异。
对5次取材结果进行评价得出,污染率由低到高依次为休眠期枝条于温室内水培催芽、新梢生长初期、新梢生长中期、盛花期、秋季休眠前期。在休眠期枝条于室温内水培和新稍生长初期取材,茎尖污染率相对较低,诱导成活率较高,这两个阶段为适宜取材时期。
表1 不同取材时期对越橘‘Koralle’茎尖诱导的影响
注:表中数据为平均值±标准差;同列不同小写字母表示在P<0.05水平下差异显著,同列不同大写字母表示在P<0.01水平下差异极显著。
2.2 消毒剂和消毒时间对茎尖诱导的影响
由表2可见,茎尖污染率和成活率不同处理间均达到差异显著水平。75%乙醇与0.1%升汞、2%次氯酸钠配合使用时,不同处理时间下,茎尖污染率和茎尖诱导成活率差异较大。9个处理中,处理1污染率最高达到76.70%,处理3污染率最低为1.11%。成活率最高的是处理2,为84.15%,成活率最低的为处理3,仅为3.33%。综合考虑,以处理2污染率相对较低,成活率最高,效果最好,即先用75%酒精灭菌30 s,再用0.1%升汞灭菌处理4 min,最后用次氯酸钠灭菌处理2 min,污染率和成活率分别为5.64%和84.15%。
表2不同消毒剂及消毒时间对越橘‘Koralle’茎尖诱导的影响
处理处理时间75%乙醇/s0.1%升汞/min2%次氯酸钠/min污染率/%成活率/%13021(76.70±2.78)a (21.75±7.58)cd23042(5.64±0.33)bc(84.15±4.78)a33063(1.11±0.08)d(3.33±2.95)d44022(45.14±5.47)b(52.42±1.58)b54043(2.45±1.27)cd(21.26±3.47)cd64061(1.55±0.14)d(15.93±3.95)cd75023(4.07±0.97)cd(37.53±2.14)b85041(5.05±1.64)bc(75.82±4.88)a95062(1.91±4.14)d(8.88±2.27)cd
注:表中数据为平均值±标准差;同列不同小写字母表示在P<0.05水平下差异显著。
2.3 培养基、激素组合对茎尖增殖的影响
由表3可见,将茎尖接种到不同处理的培养基上,不同处理间增殖系数、苗高均存在显著、极显著差异。随着ZT质量浓度的升高,增殖系数呈先增大后减小的趋势,说明高质量浓度的ZT对不定芽的分化有抑制作用;苗高随着GA3质量浓度的升高而增高。9个处理中,增殖系数最大的是处理8,为4.85,增殖系数最小的是处理1,为2.06。苗高最高的是处理7,为2.88 cm,生长最慢的是处理1,为1.79 cm。茎尖接种到MS培养基上生长最差,在WPM培养基上生长次之,而在WPM(改良)培养基上生长最好。茎尖在7号培养基上虽然高生长较大,但丛生芽抽长、细弱;茎尖在9号培养基上生长增殖系数、苗高都不如8号培养基上的表现。因此从增殖系数、苗高以及丛生芽生长情况等进行综合评价,8号处理WPM(改良)+1.0 mg·L-1ZT+0.1 mg·L-1GA3为茎尖增殖培养的最佳培养基,增殖系数为4.85,苗高达2.74 cm。
表3 不同培养基、激素组合对越橘‘Koralle’茎尖诱导的影响
注:表中数据为平均值±标准差;同列不同小写字母表示在P<0.05水平下差异显著,同列不同大写字母表示在P<0.01水平下差异极显著。
2.4 生根与移栽
选取增殖继代培养2次的健壮试管苗,温室中炼苗3~4 d后成簇取出(带有愈伤组织),在水龙头下冲洗基部,洗净培养基。在质量分数为800 μg·g-1的IBA中浸泡3 min,用消毒的水苔包裹苗,仅露出1/3~1/4顶部,栽到小营养钵(V(草炭)∶V(蛭石)=2∶1组成的基质)中诱导生根,用透光的塑料薄膜拱棚保温保湿,相对湿度控制在85%左右,温度控制在25 ℃,诱导生根,40 d后生根率达87.14%,平均根长1.25 cm。
3 结论与讨论
适宜的取材时期是降低茎尖污染率、提高茎尖诱导成活率的重要因素[9]。‘Koralle’在休眠期室内水培后萌发出的嫩芽污染最低,这个阶段可显著降低接种的污染率,提高茎尖诱导成活率,为最适宜取材时期。新梢生长中期、盛花期以及秋季休眠前的枝条顶端茎尖生长放缓,由于长时间暴露在室外,污染严重。因此,接种后不易灭菌,导致污染率较高,另外茎尖顶端分生组织分化相对缓慢,以至于诱导成活率较低,应尽量避免这些时期取材。
在茎尖培养过程中,培养基是影响茎尖成活率以及苗木状态的主要因素之一,以往用于蓝莓、红豆越橘、笃斯越橘组培过程中的培养基主要有WPM、WPM(改良)和MS,当然,同一属的不同种以及不同品种对培养基的反应有所不同,使用的培养基不能同一而论[10,18-19]。本研究发现,对于越橘品种‘Koralle’茎尖培养而言,诱导效果由优到劣的培养基排列依次为WPM(改良)、WPM、MS。
植物激素是影响茎尖诱导和增殖的关键因子之一,在组织培养中起重要作用[18]。只有选用合适的激素及质量浓度,才能获得理想的结果。以往对越橘属不同种及品种的研究显示,ZT在茎段、叶片增殖培养过程中起着关键的作用[19-20],且在0.5~2.0 mg·L-1ZT质量浓度范围内,红豆越橘、笃斯越橘以及不同品种的蓝莓达到最高增殖系数时的所需ZT质量浓度不同。也有研究表明,当ZT质量浓度高于0.8 mg·L-1时,会对蓝莓外植体诱导不定芽产生较大影响,高质量浓度ZT抑制有效芽形成,导致愈伤组织发生严重的玻璃化[21]。本研究中适于越橘品种‘Koralle’增殖培养的ZT质量浓度为1.0 mg·L-1,当ZT质量浓度达到2.0 mg·L-1时,增殖系数降低,但不定芽基部的愈伤组织并未发生玻璃化现象,这可能因品种的基因型而异。
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