单料米醋和双料米醋的挥发性成分分析

祁勇刚，李攀恒，毛志海，胡 勇，孙 俊，高 冰，黄 煌*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068；2.湖北华信制药有限公司，湖北 赤壁 437400；3.南京天汇生物技术装备有限公司，江苏 南京 210009）

食醋作为一种全球享用的酸性调味品，由于其低廉的价格、食用安全无污染的特性，深受消费者喜爱。我国的谷物醋作为世界三大食醋品种[1]（谷物醋、果醋、酒醋）之一，由于其具有来源广泛，微生物种类多、工艺独特，色泽诱人、口感柔和、香型协调，低糖、营养丰富等得天独厚的优势，受到了国内外学者的关注，并展开科学研究[2-5]。

目前，我国已经形成一批有竞争力的食醋品牌，尤其是代表四大名醋的企业品牌，但食醋市场仍以每年8%的速度增长，行业发展潜力仍然巨大[6-10]。一方面，由于食醋行业机械化、自动化程度低，受原材料价格上涨、人力成本的提高；另一方面，面对食醋日益增长的需求，矛盾逐渐显现，大多数企业部分丢弃了传统的食醋发酵方法[11]，改用半机械化的方式酿醋，从而导致食醋品质的降低[12]，而这与人们对食醋日益多样的高品质消费需求反差越来越大。因此，越来越多的学者开始对食醋品质的提高进行了深入而广泛地研究[13-15]，包括微生物、糖化发酵剂、工艺、设备、陈酿、香气成分、功效成分等方面。后来旺等[13]研究了食醋大曲培养温度对食醋品质的影响，表明大曲培养温度为32℃时，大曲中细菌最多、放线菌最少，霉菌数和酵母菌数适当，酿造的食醋在色泽、滋气味、体态等方面最佳；蒋忠等[14]研究了以大米为原料，采用乳酸菌和酵母菌混合发酵制备酒醪，优化了发酵工艺条件，再经液态深层发酵制备的食醋，不挥发酸和酯类含量较优化前分别提高了10.25倍和1.62倍，改善了食醋品质；赵敏等[15]采用自吸式发酵罐液态深层半连续法结合传统发酵工艺，筛选原料、添加糖化曲、多菌种协同发酵酿造食醋，总酸≥6.0g/100mL、不挥发酸≥0.5g/100mL，达到固态醋的国标要求；黄文韬[16]研究了温度、微波、超声波对食醋陈化的影响，通过合理处理，显著提高了食醋总酯的含量。

有关食醋的研究大多数是针对酿造微生物、发酵工艺、陈酿技术、质量、挥发性成分等方面进行的研究[17-21]，少见有对食醋的酿造原料对食醋品质与香气成分进行系统的研究，也未有专用于酿醋的原料[22]。为了酿造口感更柔和、香气更浓郁、氨基酸态氮含量更高的高品质米醋，特分别以大米、大米与豆粕为原料，选用麦曲作为糖化发酵剂，采用固态发酵罐分别酿造了单料米醋和双料米醋，采用顶空固相微萃取（head space-solidphase micro-extraction，HS-SPME）和气质联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析了两种米醋的挥发性成分，探索和比较原料营养成分对米醋香气成分的影响，验证采用大米和豆粕为原料可提高米醋品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

大米、豆粕、麸皮、谷壳：市售；麦曲：河南界中醋业集团有限公司。

1.1.2 试剂

乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸、2-辛醇、乳酸乙酯（均为色谱纯）：美国Sigma公司。

1.1.3 菌种与培养基

安琪酿酒高活性干酵母、安琪生香酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌AS1.01：广东省微生物研究所菌种保藏中心。

醋酸菌活化培养基：1%葡萄糖、1%酵母膏、2%琼脂，115℃灭菌15 min后冷却至50℃加入1%碳酸钙和体积分数为3%的乙醇溶液。

醋酸菌液体种子培养基：1%葡萄糖、1%酵母膏、115℃灭菌15 min后冷却至50℃加入体积分数4%的乙醇溶液。

1.2 仪器与设备

SPME手动进样器、75 μm CAR-PDMS、100 μm PDMS萃取头：美国Supelco公司；7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；PC-420磁力恒温搅拌器：美国Corning公司；HRN32手持折射仪：德国托摩根公司；SW-CJ-2D净化工作台：广州瑞智科学仪器有限公司；LHS-250SC型智能型恒温恒湿箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；SLY-2112B型立式双层大容量恒温培养摇床：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；YM系列A型立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；QDWZⅠ3000-7D湿法粉碎机：无锡轻大食品有限公司；50 L自动机械搅拌控温发酵罐、500 L自动机械搅拌控温发酵罐、0.5 t固态醋酸发酵罐：南京天汇生物技术设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米醋的酿造工艺流程及操作要点

单料米醋工艺流程：

操作要点：

原料粉碎：单料米醋以大米为主要糖源，双料米醋以大米、豆粕（质量比为8∶2）为主要糖源，原料均采用湿法粉碎机粉碎。

糊化、糖化：采用蒸汽加热，蒸煮糊化，50℃保温，加入麦曲糖化。

活化酵母：按说明书活化安琪酿酒高活性干酵母和安琪生香酿酒高活性干酵母。

酒精发酵：将活化好的酵母菌，加入大米糖化醪，混合均匀，33℃保温、密封，开始酒精发酵，至酒精度不再上升时，发酵结束，得酒醪。

种子液制备：按照工业用醋酸菌培养步骤[15]，制备醋酸菌种子液。

固态醋酸发酵：将100kg麸皮和125kg谷壳混合均匀加入0.5t固态醋酸发酵罐内，加入酒醪，搅拌均匀，35℃保温，接着均匀撒入制备好的醋酸菌种子液10 L，2 h后开始发酵，每隔24h翻醅，当总酸含量不变时，发酵结束。

后处理：封醅1个月后，醋醅与水按1∶1的质量比淋醋，淋出的醋液煮沸15 min，陶罐陈酿3个月。

1.3.2 样品处理

将5 mL米醋样品置于15 mL样品瓶中，加入2.5 g氯化钠，将SPME萃取头通过瓶盖插入到样品的顶空部分，退出纤维头，50℃顶空吸附40 min，搅拌转速250 r/min，萃取完成后抽回纤维头，从样品瓶中拔出萃取头，再将萃取头插入气相色谱进样口进行解吸。

1.3.3 仪器条件

色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：氦气（He）；流速：1 mL/min，不分流；进样口温度250℃；柱温：起始温度32℃，以3℃/min升温至120℃，再以10℃/min升温至250℃，保持10 min。进样量：5 μL。

质谱条件：接口温度250℃，离子源温度230℃，电离方式为电子电离（electronionization，EI）源，电子能量为70eV，四级杆温度为150℃，传输线温度为280℃，扫描质量范围33～450 amu。

1.3.4 指标测定

糖度：使用HRN32手持折射仪测定；酒精度：采用国标GB/T13662—2008《黄酒》中的酒精度方法测定；总酸、不挥发酸、可溶性无盐固形物：采用国标GB 18187—2000《酿造食醋》中的方法测定；还原糖：采用国标GB/T5009.7—2008《食品中还原糖的测定》中的方法测定；氨基酸态氮：采用国标GB 18186—2000《酿造酱油》中的方法测定；总酯：采用国标GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》中的方法测定。

1.3.5 数据处理

通过NIST08标准谱库自动检索各组分质谱数据，按照标准谱图及保留指数对机检结果进行核对和确认，列举挥发性成分的鉴定结果并比较。

2 结果与分析

2.1 单料米醋和双料米醋的质量评价

单料和双料发酵酿造的米醋在感官指标上基本一致，深褐色、有光泽，体态均一、较浓稠，有少许沉淀，滋味柔和，但在口感和香气方面有差别，单料米醋口感纯净，酯香浓郁，香气持久；而双料米醋口感醇厚，酯香、焦香、酱香协调，香气持久。

单料和双料发酵酿造的米醋的理化指标见表1。

表1 两种米醋的理化指标测定结果Table 1 Determination results of physical and chemical indexes of two kinds of rice vinegar

由表1可知，以大米和豆粕为主料发酵酿造的双料米醋的不挥发酸、氨基酸态氮、可溶性无盐固形物和总酯的含量（2.15g/100mL、0.35g/100mL、6.51g/100mL、0.43g/100mL）明显高于以大米为主料制备的单料米醋，正是由于不挥发酸、氨基酸态氮和可溶性无盐固形物的高含量，使得双料米醋滋味更柔和，口感醇厚，酯香、焦香、酱香等香气协调。

2.2 单料米醋和双料米醋的挥发性风味成分分析

单料米醋和双料米醋的挥发性风味成分的GC-MS总离子流色谱图见图1，对所有成分经谱库检索和其他方法核实，从制备的2种米醋中共鉴定出51种挥发性化合物，结果见表2，占到各自总挥发性成分的94.46%和92.65%。

图1 单料米醋（A）和双料米醋（B）挥发性成分的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in rice vinegar fermented by single raw material(A)and two raw materials(B)

表2 单料米醋和双料米醋挥发性成分的GC-MS分析结果Table 2 Results of volatile components in rice vinegar fermented by single raw material and two raw materials analysis by GC-MS

续表

由图1（A）和表1可知，单料米醋中的挥发性成分36种，占其总挥发性成分的94.46%。其中醇类3种、醛类6种、酮类2种、酸类4种、酯类11种、烃类4种、吡嗪类4种、其他2种，各类成分分别占总挥发性成分的比例为4.22%、55.44%、1.24%、29.55%、4.97%、1.94%、0.71%和1.39%。含量超过1%的挥发性成分为苯乙醇（3.83%）、糠醛（49.30%）、3-羟基-2-丁酮（1.02%）、乙酸（27.18%）、3-甲基丁酸（1.51%）、乙酸乙酯（1.02%）、乙酸异戊酯（1.06%）、乳酸乙酯（1.13%）、正十一烷（1.71%）、2-甲氧基-4-甲基苯酚（1.27%）。

由图1（B）和表1可知，双料米醋中的挥发性成分48种，占总挥发性成分的92.65%。其中醇类5种、醛类9种、酮类3种、酸类5种、酯类12种、烃类3种、吡嗪类4种、其他7种，各类成分分别占总挥发性成分的比例为4.47%、48.34%、1.65%、27.27%、7.19%、1.83%、1.10%和0.80%。含量超过1%的挥发性成分为苯乙醇（3.11%）、糠醛（47.06%）、3-羟基-2-丁酮（1.35%）、乙酸（25.45%）、3-甲基丁酸（1.51%）、乳酸乙酯（1.04%）、丙酸-2-苯乙酯（2.17%）、己酸乙酯（1.21%）、正十一烷（1.61%）。

2.3 单料米醋和双料米醋的挥发性风味成分对比分析

单料米醋以大米为糖源，而双料米醋以大米和豆粕为糖源，两者均采用固态醋酸发酵方法酿造，原料的不同可能对米醋的挥发性成分产生一定的影响。由表1可知，两种米醋挥发性成分差异较大，双料米醋的挥发性成分有48种，而单料米醋的挥发性成分只有36种。二者相同的挥发性成分共有33种，其中醇类3种，醛类5种，酮类2种，酸类4种，酯类10种，烃类3种，吡嗪类4种，其他2种。由于两种米醋均由大米作为主要原料，且酿造工艺一致，所以他们大部分的挥发性成分种类相同。

两种米醋中，含量较高的相同挥发性成分为苯乙醇（单料米醋 3.83%、双料米醋3.11%）、糠醛（49.30%、47.06%）、3-羟基-2-丁酮（1.02%、1.35%）、乙酸（27.18%、25.45%）、3-甲基丁酸（1.51%、1.19%）、乳酸乙酯（1.13%、1.04%）、正十一烷（1.71%、1.61%），两种醋中糠醛的含量均最高，根据对醋酸发酵过程中的糠醛含量的定期测定，发现糠醛含量在醋酸发酵过程中其含量缓慢增加，在封醅、煮制、淋醋和陈酿的过程中含量增速提高。

单料米醋特有的成分有3种，分别为2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-羧醛（0.05%）、3-羟基-2-丁酮-乙酸酯（0.17%）、苯乙烯（0.02%），总量为0.24%；双料米醋中特有成分有15种，分别为糠醇（0.13%）、苯甲醇（0.11%）、己醛（0.06%）、辛醛（0.03%）、5-甲基呋喃醛（0.22%）、2-吡咯甲醛（0.04%）、4-（2-呋喃基）-3-丁烯-2-酮（0.03%）、辛酸（0.05%）、丙酸-2-苯乙酯（2.17%）、己酸辛酯（0.19%）、2-乙酰基呋喃（0.25%）、5-甲基-2-乙酰基呋喃（0.05%）、邻甲氧基苯酚（0.04%）、2-乙酰基吡咯（0.02%）、4-乙基苯酚（0.02%），总量为3.41%。相比单料米醋，双料米醋中的挥发性成分减少3种，新增15种，其中新增醇类2种、醛类4种、酮类1种、酸类1种、酯类2种、其他5种，包括邻甲氧基苯酚（愈创木酚），挥发性成分种类增多，可能是由于豆粕的加入，提供了蛋白、脂质、纤维素等营养成分，降解后，经过复杂的代谢和生化反应而生成的。

单料米醋中，典型的挥发性成分有苯乙醇、糠醛、3-羟基-2-丁酮-乙酸酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯，这些为米醋特有的香气成分，其中3-羟基-2-丁酮-乙酸酯（乙偶姻）为合成川芎嗪的前体物质。双料米醋中，由于豆粕的加入，挥发性成分发生显著的变化，其中苯乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯百分含量降低，而乙酸异丁酯、己酸乙酯、丁酸乙酯显著提高，新增丙酸-3-苯乙酯、己酸辛酯、邻甲氧基苯酚等香气成分，提高了米醋的香气，丰富了米醋的香型，提升了米醋的品质。

3 结论

采用顶空固相微萃取和气质联用技术测定了分别以大米、大米和豆粕为原料酿造的单料米醋和双料米醋中的挥发性成分，分别从2种米醋中检测出48种和36种挥发性成分，占各自总挥发性成分的94.46%和92.65%。2种方法制备的米醋中，都含有醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、烃类、吡嗪类、苯酚和呋喃类物质，醛类、酸类、酯类和吡嗪类是米醋中主要的挥发性成分。

单料米醋中含有3种双料米醋中未有的挥发性成分；双料米醋比单料米醋多12种挥发性成分，且有更高含量的游离氨基酸，米醋口感更柔和、提高了香气、丰富了香型，提升了产品品质，豆粕原料来源广、处理简单、因此，选用大米和豆粕酿造的高品质双料米醋值得推广应用。

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