留兰香薄荷离体快繁技术研究

吴雯雯， 陆 兵， 李文清， 邵元健

(南通科技职业学院，江苏南通 226007)

留兰香薄荷(MenthaspicataLinn)是一种多年生宿根草本植物，用途广泛，全草可入药，广泛用于中医药领域，也是世界著名的香料植物，具有较高的药用、食用和工业价值[1]。我国留兰香主要种植在江苏南通及安徽太和地区，目前品种混杂退化严重，其主要原因是随着薄荷市场的低迷，农民种植薄荷的积极性越来越低，母本难以妥善保留。利用植物组织培养的方式，可以很好地实现种质资源的保存和规模化生产[2]。国内关于留兰香组织培养的研究已经有一些，但不是很多，而且不同的研究，结果也不尽相同。柴明良以留兰香玻璃苗为对象，对诱导愈伤组织再生正常植株的培养基条件进行了探索[3]。王小敏等以留兰香茎尖为试验材料，主要研究了外植体消毒、不定芽增殖和试管苗移栽生根的条件[4]。申顺先等以留兰香含顶芽幼嫩茎段为外植体，对芽诱导、增殖和生根进行了研究[5]。这些研究都为留兰香薄荷的组织培养打下了良好的基础。本试验以露地栽培的留兰香带芽茎段为材料，对留兰香离体快繁技术进行研究，旨在为留兰香工厂化育苗和种质资源保存提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验于2015年7月至2016年2月在南通科技职业学院组培室进行。供试材料为留兰香，引种于南通如皋客来花卉园艺场，现栽培于南通科技职业学院苗圃基地。

1.2 主要药剂和仪器

药剂：NaClO、HgCl2、乙醇、6-BA、NAA、MS、N5、B6等均由国药集团化学试剂有限公司生产；组培抗菌剂(简称PPM)，购自北京西美杰科技有限公司。仪器：超净工作台、培养架、空调、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、pH试纸、移液管、容量瓶、营养钵、滤纸、玻璃棒等。

2 试验设计

2.1 初代培养

2.1.1 获取外植体 本试验选取露地栽培，生长旺盛的留兰香茎段为外植体，叶片全部除去，顶芽和腋芽保留。用2%的洗衣粉溶液浸泡外植体并不断搅拌，用刷子仔细刷新，自来水洗净，纱布包好，在流水中淋洗2 h后，置于超净工作台上。

2.1.2 外植体消毒试验 外植体置于消毒好的烧杯里，用75%的乙醇杀菌30 s，然后分别用消毒剂消毒(表1)，消毒后用无菌水冲洗5～10次。将消毒后的外植体接种到准备好的培养基上，每个处理设10次重复，每瓶接种4个外植体，10 d 后记录萌动率、污染率和死亡率。培养温度为(25±1) ℃，光照1 500～2 000 lx，湿度80%左右，光照12 h/d。

表1 不同消毒剂和不同消毒时间对消毒效果的影响

2.1.3 芽诱导试验 待萌发的不定芽长到2～3 cm时，选取长势较好的小苗，重新切成1 cm的茎段，转接到培养基上，培养基设3种：(1)MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；(2)MS+0.1 mg/L NAA；(3)MS，分别加入30 g/L蔗糖、7 g/L琼脂。每个处理设10次重复，每瓶接种4个茎段。21 d后观察芽诱导率和分化率。

2.2 继代培养

切取初代培养的无菌芽苗，切成1～2 cm的小段，分别接种于增殖培养基上。考察培养基、6-BA、NAA和蔗糖这4种因素对增殖培养的影响，采用L9(34)正交试验设计[6]。每个处理接种10瓶，重复3次，21 d后观察分化增殖情况和苗健壮度。

将培养1个月的增殖苗切割不同部位，即顶芽、距离顶芽的第1个茎段、距离顶芽的第2个茎段、距离顶芽的第3个茎段，不同植株相同部位的苗转接至同一瓶中，每个部位作为1个处理，每个处理重复3次，21 d后观察苗的株高、直径和增殖系数。

2.3 生根培养

将增殖培养基中的有效生产苗取出，接种到生根培养基上，进行生根培养。基本培养基为1/2MS培养基，NAA设3个浓度(0.1、0.2、0.5 mg/L)，分别加入15 g/L蔗糖、7 g/L琼脂。每个处理设3个重复，每个重复接种10株。30 d后观察生根率和根的状况。

2.4 结果统计及分析

污染率=污染外植体数/接种外植体数×100%；死亡率=死亡外植体数/接种外植体数×100%；萌动率=萌动外植体数/接种外植体数×100%；诱导率=有不定芽产生的外植体数/接种外植体数×100%；增殖系数=单个外植体再生形成的芽的平均数；生根率=生根外植体数/接种外植体数×100%。

3 结果与分析

3.1 初代培养试验结果

3.1.1 不同消毒剂和不同消毒时间对消毒效果的影响 将消毒处理后的茎段接种在初代培养基上，7 d后，幼芽开始萌动(图1)。研究发现，不同消毒剂和消毒时间的消毒效果不同。随着消毒时间的延长，污染率呈下降趋势，但是死亡率呈上升趋势，萌动率在用消毒剂0.1% HgCl2+2滴PPM消毒10 min时出现最大值，为75%。可见，选取的留兰香茎段，用75%乙醇杀菌30 s，然后用消毒剂0.1% HgCl2+2滴PPM 消毒10 min，表面消毒灭菌效果最好，用NaClO消毒效果最差。

3.1.2 不同激素浓度对芽诱导的影响 接种的茎段培养7 d后明显萌发，21 d后顶芽生长达3～5 cm，底部有不定芽。芽诱导率基本都在80%以上，基本培养基MS适合不定芽生长，激素组合对芽诱导率影响不大。各种激素组合与浓度对分化产生了明显的影响，处理3培养基中顶芽诱导出的平均不定芽数为4.7个，诱导效果最好，随着激素浓度的增加，诱导的不定芽数反而降低(表2、图2)。结果说明，处理3，即只用MS基本培养基，不添加激素，为初代培养的最优培养基。

表2 6-BA和NAA对芽诱导的影响

3.2 继代培养试验结果

3.2.1 不同培养基、激素和蔗糖组合对不定芽继代增殖的影响 极差分析表明，4个因素对增殖系数产生影响由主到次的顺序为基本培养基、6-BA、NAA、蔗糖(表3)，说明培养基种类对芽分化和生长起着关键作用，MS培养基效果最好，N5和B6培养基均不适合留兰香芽增殖试验。蔗糖浓度对增殖的影响最弱，但是蔗糖浓度过高，反而会抑制苗的生长。6-BA 影响芽的诱导，浓度提高，分化率也提高，但浓度过高，无根苗会瘦弱，健壮度降低，要经多次壮苗方能生根移栽，反而影响繁殖效率；若浓度太低，无根苗数量会大大减少。综合增殖系数和苗健壮度，选择MS为基本培养基，添加0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+25 g/L蔗糖，分化出的组培苗较多较大，易壮苗生根(图3)。

表3 不定芽增殖 L9(34)正交试验配方组合试验结果

注：“*”越多，表明苗越健壮。

3.2.2 不同部位对不定芽增殖的影响 研究发现，留兰香不同的生长部位对增殖有很大的影响，靠近基部的部位，由于有了一定的木质化程度，因此增殖系数最低，而靠近顶芽的下面第1个茎段的分蘖程度不如距离顶芽的第2个茎段完全，而顶芽生长最好，是最有利于增殖的部位，同时也有利于工厂化大量生产(表4)。

表4 不同部位对不定芽增殖的影响

3.3 生根培养试验结果

研究发现，留兰香组培苗较易生根，在3种NAA浓度下，生根率都达到了100%。添加的NAA浓度为0.1 mg/L时，根粗壮，有较多的毛细根，这种根系吸收面积大，吸收能力强，移栽时成活率高(表5、图4)。因此，适宜生根的NAA浓度为0.1 mg/L。

表5 NAA浓度对生根的影响

3.4 炼苗移栽

将生根状态理想的组培苗连同培养容器从培养室取出，置于温室大棚中，在自然光照下进行适应性锻炼10 d，再打开瓶口2 d。炼苗后，将组培苗从瓶中小心取出，洗干净黏附在根部的培养基，用0.1%的多菌灵1 000倍溶液浸根，然后移栽至已经高锰酸钾消毒的基质中(沙子 ∶草炭土为1 ∶1)。注意保持水分供需平衡，防止杂菌孳生，一般移栽成活率可达到85%(图5)。

4 讨论与结论

本研究结果表明，初代培养的最佳条件为MS基本培养基+30 g/L蔗糖，不加激素，产生的不定芽数最多，诱导率也较高；继代培养的最佳条件为MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+25 g/L蔗糖，选用顶芽部位进行增殖更有利于留兰香最后的生根比例；生根培养的最佳条件为1/2MS+0.1 mg/L NAA+15 g/L蔗糖，通过此途径长成的薄荷苗大多健壮，茎粗壮，叶片肥厚，容易生根。

试验结果显示，在组织培养整个过程中，留兰香对6-BA和NAA的浓度需求都比较低，如果激素浓度稍高，反而会抑制试管苗的生长，同时会长出较多气生根，这与王丽等的研究[7]一致。

本研究以留兰香茎段为外植体进行薄荷离体快繁研究，因为留兰香茎段上茸毛较多，腋芽与茎秆的交界处难以消毒干净，所以在外植体消毒时，先用75%的乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2+2滴PPM 消毒10 min，杀菌效果较好。PPM是美国Plant Cell Technology专门为植物组织培养而研发的高效抗菌试剂，目前还尚未有在薄荷外植体消毒中使用的报道。由于培育的苗还未进行成分分析，具体使用PPM后，对薄荷精油的品质是否有影响，还需进一步研究。

[1]张泽宏，王兵丽，陈巧玲. 薄荷组织和细胞培养的研究进展[J]. 漳州师范学院学报(自然科学版)，2013(3)：93-95.

[2]陈世昌. 植物组织培养[M]. 2版.北京：高等教育出版社，2015：227-230.

[3]柴明良. 留兰香玻璃苗愈伤组织化再生正常植株[J]. 植物生理学通讯，1991，27(5)：371.

[4]王小敏，梁呈元，李维林. 留兰香组织培养及快速繁殖条件的优化[J]. 植物资源与环境学报，2007，16(4)：38-42.

[5]申顺先，李学慧，贺爱利，等. 留兰香微繁技术体系研究[J]. 北方园艺，2013(13)：146-149.

[6]盖钧镒. 试验统计方法[M]. 北京：中国农业出版社，2000：285-290.

[7]王 莉. “草原”美国薄荷的组织培养及挥发油成份研究[D]. 雅安：四川农业大学，2008：43-45.