枯草芽孢杆菌HAINUP40水质净化作用的研究

刘树彬，王新锐，林壮其，蔡 岩，吴 越，刘 象，周永灿，王世锋

(1.海南大学，南海海洋资源利用国家重点实验室，海南 海口 570228；2.海南大学 海洋学院，热带生物资源教育部重点实验室，海南 海口 570228；3.海南大学 海洋学院，海南省水生生物技术重点实验室，海南 海口 570228；4.海南省蓝色海洋生物科技有限公司，海南 海口 570100)

随着水产养殖业迅速发展，集约化养殖规模日益扩大和养殖密度的不断提高[1]，养殖过程中产生的大量鱼虾排泄物和残饵，使得水体中的有机物、亚硝酸盐氮、氨氮等有害物质含量增加，使得养殖动物免疫力降低，生长速度减慢，导致疾病爆发和死亡[2]，严重限制了水产养殖业的可持续发展。近年来，水产养殖业者通过使用益生菌，一方面通过向水体中添加微生态制剂，促进水体中有机物等污染物的矿化与分解，改善养殖池塘的水质，降低对环境的污染[3]，取得了良好的效果。另一方面，向水产动物饲料中添加益生菌，提高了水产动物的生长速度和免疫力，并在增强水产动物抵抗病原侵染的能力等方面取得了重要的研究进展。

目前，水产上广泛使用的具有水质改良效果的益生菌种类繁多，包括芽孢杆菌、光合细菌、复合EM菌、硝化细菌、乳酸菌等[4]。其中，芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)由于具有多种优良特性而在水产养殖中得到了广泛应用[5]。首先，枯草芽孢杆菌能够分泌大量的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等胞外酶，能迅速降解残饵和排泄物中的淀粉、蛋白质和脂肪等有机物，加快水体中有机物的矿化与分解，从而达到净化水质的目的[6]；其次，枯草芽孢杆菌可分泌多肽类物质和细菌素类物质等，能抑制病原菌的滋生，提高动物的免疫力[7]；另外，枯草芽孢杆菌可形成芽孢，从而表现出对环境较强的耐受性，以便于储存和运输等。已有研究表明，枯草芽孢杆菌具有较好的净化水质的作用[8-10]。

本实验室从天然水体中分离筛选到一株枯草芽孢杆菌HAINUP40[11]，该菌株对鱼源致病性无乳链球菌(Streptococcusalactolyticus)具有较强拮抗作用，拌料投喂可提高尼罗罗非鱼(Oreochromisnilloticus)的非特异免疫力和抵抗无乳链球菌感染能力；而且枯草芽孢杆菌HAINUP40具有较强的胞外蛋白酶和淀粉酶活性[12]。因此，笔者对枯草芽孢杆菌HAINUP40的水质净化效果进行研究，以期为研制同时具有预防无乳链球菌疾病和水质改良效果的微生态制剂奠定基础，亦为水产养殖多功能微生态制剂的开发和利用提供优良的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源

试验所用枯草芽孢杆菌菌种(菌株编号：HAINUP40，NCBI序列号：KY244143.1)为本实验室分离并鉴定，-80 ℃保存备用。

1.1.2 培养基配方

枯草芽孢杆菌HAINUP40生长曲线测定的培养基配方：

(1)普通淡水培养基：酵母粉1 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL。pH：7.6～7.8。

(2)普通海水培养基：酵母粉1 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化钠30 g，蒸馏水1000 mL。pH：7.6～7.8。

(3)细菌基础培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL。

(4)2216E培养基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸高铁0.01 g，陈海水1000 mL。pH：7.6～7.8。

(5)氨氮降解菌筛选培养基：酵母粉1 g，牛肉膏3 g，氯化铵0.078 g，硫酸铵0.1 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL。pH：7.6～7.8。其中氨氮含量约为30 mg/L[13]。

1.1.3 模拟废水配制

(1)模拟废水基础配方参考张峰峰等[14-15]的配方并加以改进：豆粕粉0.6 g，麦麸0.6 g，氯化铵0.078 g，硫酸铵0.1 g，磷酸二氢钾0.018 g，硝酸钾0.6 g，七水合硫酸镁0.013 g，二水合氯化钙0.043 g，七水合硫酸亚铁0.005 g，氯化钠0.0016 g，无菌水1000 mL。pH：7.0～8.5。

(2)高含量氨氮和化学需氧量模拟废水配方：在模拟废水基础配方的基础上，每升模拟废水氯化铵和硫酸铵添加量各提高至4倍，豆粕粉和麦麸添加量各提高至2倍。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

取-80 ℃保藏的枯草芽孢杆菌HAINUP40，用普通淡水培养基活化后，在37 ℃生化培养箱中倒置培养24 h，挑取单个菌落接种于100 mL 普通淡水液体培养基中，37 ℃，180 r/min恒温振荡培养24 h，形成种子液。

1.2.2 最适培养基筛选

利用全自动生长曲线测定仪(Bioscreen C 型，芬兰Bioscreen公司)测定枯草芽孢杆菌HAINUP40在37 ℃下在4种液体培养基(细菌基础液体培养基、普通淡水液体培养基、普通海水液体培养基、2216E液体培养基)中的生长曲线，以空白培养基为对照，每隔1 h测定一次吸光值，并在试验结束时绘制生长曲线，选出该菌株最适生长的液体培养基。

1.2.3 枯草芽孢杆菌HAINUP40对氨氮降解培养基的作用

试验在6个500 mL锥形瓶中进行，在每个锥形瓶中加入300 mL氨氮降解菌筛选培养基，灭菌后放置在阴凉处。静置2 d后随机分为2组，对照组不添加枯草芽孢杆菌HAINUP40，试验组添加枯草芽孢杆菌HAINUP40，添加终密度为4.74×106cfu/mL，分别在试验开始的第0、6、12、24、48、72、96 h无菌操作取水样，经0.22 μm滤膜过滤后测定氨氮和亚硝酸盐氮含量。

1.2.4 枯草芽孢杆菌HAINUP40接种密度对模拟废水的净化作用

试验在12个玻璃缸(直径23.00 cm，高33.00 cm，容积12 L)中进行。在每个玻璃缸中加入5 L模拟废水，缸口用纱布遮盖，放置在阴凉处。静置2 d后随机分为4组，分别添加枯草芽孢杆菌HAINUP40使水体中菌液终密度分别为0 cfu/mL(对照组)、8.64×105cfu/mL、8.64×106cfu/mL和8.64×107cfu/mL[16]，每组设3个平行。于试验开始后的第3、6、9、12、24 h自每个缸中取水样，经0.22 μm滤膜过滤后测定亚硝酸盐氮、氨氮、化学需氧量、pH等水质指标，每次取水样后补充相应量的无菌水。

1.2.5 枯草芽孢杆菌HAINUP40对高含量氨氮和化学需氧量模拟废水的净化作用

试验在6个玻璃缸(直径23.00 cm，高33.00 cm，容积12 L)中进行,在每个玻璃缸中加入5 L高含量氨氮和化学需氧量模拟废水，缸口用纱布遮盖，放置在阴凉处。静置2 d后随机分为2组,对照组不添加枯草芽孢杆菌HAINUP40，试验组添加枯草芽孢杆菌HAINUP40，添加终密度为1.2.4中确定的净水效果最佳的密度，每组3个平行,在试验开始后的第0、6、12、24 h以及2、3、4、5、6、7 d测定水质指标(亚硝酸盐氮、氨氮、化学需氧量及pH)。

1.2.6 枯草芽孢杆菌HAINUP40对养殖废水的净化作用

在海南大学海洋学院附近养殖池塘(采水位置为水面下0.3 m，透明度25～30 cm)采水样5 L，静置2 d后分装入500 mL锥形瓶中。试验分为A、B、C、D、E 5组。其中A组放置于室内阴凉处，C组放置于室内光照处，E组放置于暗箱内；B组和D组添加枯草芽孢杆菌HAINUP40，终密度为7.36×106cfu/mL，其中B组放置在室内光照处，D组放置在暗箱内。每组3个平行样，分别在试验开始后第0、6、12、24、48、72 h测定水质指标(亚硝酸盐氮、氨氮、化学需氧量及pH)。

1.2.7 水质指标测定

参照陈国华[17]的方法，采用重氮偶氮法测定亚硝酸盐氮，采用次溴酸钠氧化法测定氨氮，采用碱性高锰酸钾法测定化学需氧量，利用pH测定仪(DELTA320型，梅特勒—托利多公司)进行pH测定。对每组每个时间点取双样进行平行测定。

1.3 数据分析

采用 SPSS 17.0 统计软件计算测定数据平均值、标准差以及进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌HAINUP40适宜培养基筛选

枯草芽孢杆菌HAINUP40在4种液体培养基(细菌基础液体培养基、普通淡水液体培养基、普通海水液体培养基、2216E液体培养基)中进行培养,测定并绘制生长曲线(图1)。结果表明，枯草芽孢杆菌HAINUP40在4种培养基中进入对数生长期的时间点为第3 h，但枯草芽孢杆菌HAINUP40在达到吸光值基本相同的稳定期所用时间不同。枯草芽孢杆菌HAINUP40在4种培养基中进入稳定期用时分别为：普通淡水培养基9 h，细菌基础培养基13 h，2216E培养基18 h，普通海水培养基22 h。可见，枯草芽孢杆菌HAINUP40在不同培养基中的生长速度不同，由快到慢依次为普通淡水培养基>细菌基础培养基>2216E培养基>普通海水培养基，为此，利用普通淡水培养基对枯草芽孢杆菌HAINUP40进行扩大培养为后续试验提供菌液。

图1 枯草芽孢杆菌HAINUP40在4种培养基下的生长曲线注:各组空白对照的数值较接近，在图1中显示为基本重合的直线.

2.2 枯草芽孢杆菌HAINUP40降解氨氮效果

将枯草芽孢杆菌HAINUP40添加到氨氮降解菌筛选培养基中，与对照组相比，试验组的氨氮在第6 h有明显的升高(P<0.05)，然后氨氮质量浓度逐渐降低，并在第4 d时降至11.2 mg/L，相较于起始氨氮质量浓度26.4 mg/L，氨氮去除率达到57.58%(图2a)。亚硝酸盐氮质量浓度基本维持在0.01 mg/L的较低水平(图2b)，试验组仅在第12 h亚硝酸盐氮明显升高(P<0.05)随后第24 h又降至0.01 mg/L的低水平，试验组与对照组在其余时间点并无显著差异(P>0.05)。

2.3 枯草芽孢杆菌HAINUP40接种密度对模拟废水净化的作用

将密度为105、106cfu/mL和107cfu/mL的枯草芽孢杆菌HAINUP40分别添加到模拟废水中，与对照组相比，3个试验组在24 h内对水体中化学需氧量和pH均具有显著的降低作用(P<0.05)。其中，在24 h时对化学需氧量去除率分别为69%、69%和81%(图3a)，水体pH随着时间的推移逐渐降低，但菌的添加密度对pH的下降趋势没有影响，且下降速率基本一致，从初始的8.0降至6.8，均显著低于对照组的pH7.9(图3b)(P<0.05)。水体中的亚硝酸盐氮质量浓度在试验组和对照组间没有明显差异(P>0.05)，在24 h内均表现出先升后降(图3c)。水体中氨氮的质量浓度，在对照组中一直处于上升趋势，并在第24 h时达到峰值，3试验组则呈现先升后降的趋势(图3d)。其中，添加106cfu/mL试验组在第3 h氨氮质量浓度开始增加，在第9 h达到最大值之后下降。其他组在第6 h开始升高，105cfu/mL和107cfu/mL试验组分别在第9 h和第12 h达到峰值之后有所下降。

图2 枯草芽孢杆菌HAINUP40对降解氨氮菌培养基的亚硝酸盐氮和氨氮的影响a:氨氮；b:亚硝酸盐氮.

可见，向模拟废水中添加密度为106cfu/mL的枯草芽孢杆菌HAINUP40，可快速的对水体中的有机物降解，转化为铵态氮和亚硝酸态氮等无机物，为此，后续试验添加菌的密度均选取106cfu/mL。

2.4 枯草芽孢杆菌HAINUP40对高含量氨氮和化学需氧量模拟废水的净化作用

选取106cfu/mL作为接种密度来研究枯草芽孢杆菌HAINUP40对高含量氨氮和化学需氧量模拟废水的影响,结果显示，试验组和对照组的化学需氧量浓度随着时间的推移都有一个下降的趋势，与对照组相比，试验组下降趋势明显(P<0.05)，7 d对化学需氧量的去除率达到90.37%(图4a)。pH在对照组和试验组中均显示为先降后升的趋势。其中，试验组pH在第12 h时候达到最低值7.25，此后逐渐升高，在第5～7 d恢复到pH约8.0；对照组pH在第24 h达到最低值，之后逐步升高，在第7 d的时候同样恢复到pH约8.0(图4b)。亚硝酸盐氮质量浓度在对照组和试验组中均显示为先升后降的趋势，均在第24 h达到峰值。然而试验组在第2 d时，其亚硝酸盐氮质量浓度降至1.67 mg/L，而对照组则在第3 d才降到与试验组相同水平(图4c)。对氨氮的测定结果显示，无论是试验组还是对照组，氨氮质量浓度在整个试验周期内均显示为增高的趋势，与对照组相比，枯草芽孢杆菌HAINUP40对高含量氨氮和化学需氧量废水中的氨氮降解效果不显著(P>0.05)(图4d)。

2.5 枯草芽孢杆菌HAINUP40对养殖废水的净化效果

将枯草芽孢杆菌HAINUP40添加到养殖废水中，无论是有光照的B组还是无光照的D组，与未添加菌的A组、C组和E组相比，水样中亚硝酸盐氮、氨氮质量浓度，pH和化学需氧量在第72 h都显著降低(P<0.05)(图5)。其中，B组和D组在72 h时对亚硝酸盐氮去除率达到94.12%，而A组、C组和E组的亚硝酸盐氮质量浓度均大幅度增加。添加枯草芽孢杆菌HAINUP40的B组和D组，氨氮和化学需氧量均有一个先升后降的过程，在第72 h之后，均显著低于不添加菌株的A组、C组和E组(P<0.05)，化学需氧量去除率达到72.13%。添加枯草芽孢杆菌HAINUP40的试验组与对照组相比，pH显著降低并在第48 h开始至试验结束维持在pH7.5左右。

3 讨 论

3.1 枯草芽孢杆菌HAINUP40对水体氨氮和亚硝酸盐氮的影响

无论是淡水还是海水养殖过程中，水体中过量的氨氮、亚硝酸盐氮等营养盐都会影响养殖鱼类的正常生长。在本研究中，将枯草芽孢杆菌HAINUP40接种到氨氮降解菌液体培养基中，4 d氨氮去除率为57.58%，可见该菌株具有较好的降低氨氮的效果。在氨氮降解菌培养基培养试验中，添加枯草芽孢杆菌HAINUP40的试验组与对照组相比，水体中的氨氮呈现先升(第6、12和24 h)后降(第2、3、4 d)的趋势，在模拟废水试验、高含量氨氮和化学需氧量试验和养殖废水试验中也都存在相同的现象。枯草芽孢杆菌属于化能异养型微生物[18]，对蛋白质等有机物的利用是通过胞外蛋白酶在细胞外将蛋白质分解为多肽、氨基酸和铵态氮，然后进行吸收与利用。水体中含氮有机物在微生物氨化作用下所形成的氨氮，会继续在微生物的作用下，通过消耗溶解氧而进一步氧化为亚硝酸盐氮和硝酸盐[19]。在本研究中氨氮质量浓度呈上升趋势，这可能是由于枯草芽孢杆菌对有机物进行水解，所产生的氨氮超出了硝化作用所能承载的量,终究导致氨氮质量浓度逐渐积累上升[20]。

水体中的氨氮会在细菌的作用下氧化为亚硝酸盐氮和硝酸盐[19]。在本研究中，将枯草芽孢杆菌HAINUP40接种到氨氮降解菌液体培养基中，氨氮质量浓度在第6 h达到峰值，亚硝酸盐氮质量浓度在第12 h达到峰值，在第24 h亚硝酸盐氮质量浓度恢复到较低水平，这可能是枯草芽孢杆菌HAINUP40具有将氨氮转化为亚硝酸盐氮甚至硝酸盐的能力。在亚硝酸盐氮去除方面，沈南南等[21]将芽孢杆菌添加到养殖水体中，5 d对亚硝酸盐氮去除率为13.54%。李存玉等[22]利用混合的植物乳杆菌和芽孢杆菌，研究其对养殖水体亚硝酸盐氮的去除效果，结果发现5 d对亚硝酸盐氮去除率为57.8%。在本研究中，将枯草芽孢杆菌HAINUP40添加到养殖废水中，试验组的亚硝酸盐氮质量浓度急剧下降，在第12 h降至0.01 mg/L，且维持到试验结束，12 h对亚硝酸盐氮去除率达到94.12%，显示该菌对亚硝酸盐氮具有较好的去除效果。不过在模拟废水试验和高含量氨氮和化学需氧量试验研究中，与对照组相比，添加枯草芽孢杆菌HAINUP40后水体亚硝酸盐氮质量浓度在较短时间即达峰值。这可能是由于水体中细菌对有机物的分解利用消耗大量氧气，抑制了氨氮的硝化作用，导致氨氮和亚硝酸盐氮在水中积累[23]。

图3 不同接种密度对化学需氧量、pH、亚硝酸盐氮和氨氮质量浓度的影响a:化学需氧量；b:pH；c:亚硝酸盐氮；d:氨氮.

图4 枯草芽孢杆菌HAINUP40对高含量氨氮和化学需氧量模拟废水化学需氧量、pH、亚硝酸盐氮和氨氮的影响a:化学需氧量；b:pH；c:亚硝酸盐氮；d:氨氮.

图5 枯草芽孢杆菌HAINUP40对养殖废水亚硝酸盐氮、氨氮、pH和化学需氧量影响a:亚硝酸盐氮；b:氨氮；c:pH；d:化学需氧量.

3.2 枯草芽孢杆菌HAINUP40对水体化学需氧量的影响

马建新等[24]研究表明，养殖水体中高化学需氧量是导致养殖动物疾病爆发流行的主要原因之一。在养殖生产过程中，如能降低水体中的化学需氧量，不仅可以降低病害的发生，还可显著提高水产养殖动物的特定增长率，降低饵料系数等[25]。胡咏梅等[26]用枯草芽孢杆菌净化模拟废水48 h对化学需氧量去除率为67%；孟睿等[27]用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)混合对养殖废水9 d对化学需氧量去除率为67.97%。本研究将枯草芽孢杆菌HAINUP40添加到模拟废水和养殖废水中，在模拟废水中24 h对化学需氧量去除率最高可达81%，7 d对化学需氧量去除率可达90.37%，在高含量氨氮和化学需氧量试验中，7 d对化学需氧量去除率可达90.37%，在养殖废水中72 h对化学需氧量去除率可达72.13%，可见枯草芽孢杆菌HAINUP40具有优良的降化学需氧量的能力。

3.3 枯草芽孢杆菌HAINUP40对水体pH的影响

pH是水体综合理化因子的反映。它对水生动物渗透压的调节及体内各种代谢的正常运转具有重要意义，是水产养殖中的一个重要生态因子[28]。将枯草芽孢杆菌HAINUP40添加到模拟废水和养殖废水中，pH均有一个降低的过程。在养殖过程中，酸性环境可使养殖动物血液的pH下降，载氧能力下降，致使养殖动物缺氧死亡[29-30]。不过，在本研究中，向模拟废水、养殖废水中添加枯草芽孢杆菌HAINUP40可降低水体的pH，但pH最低依然在6.9以上，并且在24 h后会有一个升高的趋势，可见枯草芽孢杆菌HAINUP40在短期内会造成pH的下降，但对水体的pH总体影响不大。

综上所述，枯草芽孢杆菌HAINUP40可有效降低水体中的氨氮、亚硝酸盐氮质量浓度和化学需氧量。另外，由于该菌对罗非鱼源致病性无乳链球菌拮抗作用，通过拌料投喂可提高尼罗罗非鱼的非特异性免疫力和抵抗无乳链球菌感染能力[12]。因此，在罗非鱼养殖生产中，枯草芽孢杆菌HAINUP40不仅可以作为水质改良剂改善水体环境，还可作为饲料添加剂提高罗非鱼的疾病抵抗力，预防无乳链球菌疾病的发生。

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