美洲大蠊乙醇提取物中原儿茶酸超高效液相色谱定量分析方法的建立

2018-03-26郭昕巩荣艳朱娟娟曾成娟沈咏梅岳碧松李静

四川动物 2018年2期

郭昕，巩荣艳，朱娟娟，曾成娟，沈咏梅，岳碧松，李静*

1. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065；2.四川省药用动物工程技术研究中心，四川好医生攀西药业有限责任公司，成都610031)

美洲大蠊Periplanetaamericana隶属于昆虫纲Insecta蜚蠊目Blattaria大蠊属Periplaneta，是重要的药用昆虫，临床上对创面的修复及愈合具有明显的促进作用，同时还具有消炎抗菌、保肝抗肿瘤、增强机体免疫力等功能(胡艳芬等，2008；史未名，2012；吴红梅等，2013；汤雁利等，2014；陈启亮等，2015；张汉超等，2017)。原儿茶酸(protocatechuic acid，PCA)化学名称为3，4-二羟基苯甲酸，是一种天然的酚酸类物质。研究显示，这种广泛存在的化合物在抗癌、抗氧化、神经保护、修复缺血损伤，以及治疗阿尔兹海默病、过敏性哮喘、帕金森症、乙型肝炎等方面都发挥了重要作用。PCA具有多样的生物活性，如提高心肌耐氧能力、减慢心率、抗高血糖以及抗肿瘤，此外，还具有抗菌、抗炎、镇痛、抑制细胞凋亡、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、祛痰等功能，临床上常用于治疗慢性气管炎，同时PCA能够抑制体外的化学致癌物质，达到促凋亡和抗增殖的效果，具有潜在的化学防护及抗乙肝病毒价值(Anetal.，2006；魏苗苗，2013；黄非，2017；张晓燕等，2017)。研究表明，美洲大蠊除了含有大量的脂肪酸、多糖、氨基酸、多元醇(杨勇勋，2013；满红霞等，2014；周芹芹等，2015)，还含有水杨酸、PCA及核苷酸类成分。学者们已通过高效液相色谱法建立了定量分析美洲大蠊提取物中尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷含量的方法(杨勇勋，2013；周苏，2013；黄博等，2014；蒋文贤等，2015；李旸等，2015；温慧敏等，2015)。但迄今为止，关于美洲大蠊中其他药理活性成分的定量分析仍缺乏相关报道。

美洲大蠊乙醇提取物是康复新液上市药品的基础成分，吕娜等(2017)通过萃取、制备型液相和波谱法发现美洲大蠊乙醇提取物含有PCA，但其在美洲大蠊乙醇提取物中的含量分析尚未见报道。

超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)与传统的高效液相色谱相比，具有分离度更高、分析速度更快、检测器灵敏度更高的特点。UPLC色谱柱采用粒径小于2 μm的填料，显著增加了柱的效能。与传统的C18色谱柱相比，T3色谱柱能保证与100%水相流动相兼容，对不同极性的化合物均有良好的保留，在分析过程中适用范围更广。本文拟通过外标法在UPLC上运用T3色谱柱建立定量分析美洲大蠊乙醇提取物中PCA的方法，同时测定PCA的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器材料

Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，配备ACQUITY Arc系统及PDA检测器；ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，美国Waters公司。

美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液(批号：B170205)由四川好医生攀西药业有限责任公司提供；PCA(批号：223812，J & K Chemical公司)，质量分数≥98%。

1.2 样品制备

美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液经13 000 r·min-1高速离心1 min，取上清液过膜后，每个样品瓶分装1.5 mL，分装6个样品瓶备用，作为供试品。

称取0.016 g PCA溶于100 mL甲醇配成浓度为160 μg·mL-1的PCA对照品溶液，再加甲醇等比例依次稀释到80 μg·mL-1、40 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1，每个浓度保留10 mL，置于4 ℃冰箱备用。

1.3 系统适应性实验

美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液、浓度为160 μg·mL-1的PCA对照品溶液各1 mL，13 000 r·min-1高速离心1 min，取上清液过膜后备用。精确称取1 mg PCA加入到3 mL美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中，充分溶解后离心过膜，作为加样对照组。上述样品均按照本实验建立的色谱条件进样分析。

1.4 方法学实验

1.4.1线性关系考察在本实验建立的色谱条件下，按照浓度由低到高的顺序对5个浓度PCA对照品溶液依次进样分析。分别记录各个浓度PCA对照品溶液的相对峰面积。然后以浓度为横坐标、相对峰面积为纵坐标绘制标准曲线，进行线性分析(姚静倩等，2009；周苏，2013；李宇驰等，2016)。

1.4.2精密度实验取1 mL 160 μg·mL-1的PCA，离心过膜后在本实验建立的色谱条件下连续进样6次，以PCA对照品溶液的峰面积计算相对标准偏差(RSD)(姚静倩等，2009；周苏，2013；李宇驰等，2016)。

1.4.3稳定性实验取1份供试品在本实验建立的色谱条件下每隔2 h进样1次，共进样6次。取6组中PCA所对应的峰面积计算RSD，评估样品的稳定性(姚静倩等，2009；周苏，2013；李宇驰等，2016)。

1.4.4重复性实验取6份供试品在本实验建立的色谱条件下每份样品进1针，不间断分析。取6组中PCA所对应的峰面积计算RSD(姚静倩等，2009；周苏，2013；李宇驰等，2016)。

1.4.5加样回收实验取3份10 mL已知含量的美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液按照1∶2、1∶1、2∶1(已知量∶添加量)比例向其中分别添加1.00 mg、0.50 mg、0.30 mg PCA，每种添加浓度进行3次平行实验，实验数据取平均值；根据加样回收率=(测得量-固有含量)/加入量×100%计算(姚静倩等，2009；周苏，2013；李宇驰等，2016)。

2 结果

2.1 UPLC洗脱条件建立

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm；1.8 μm)，样品温度25 ℃，进样量1 μL，柱温40 ℃，流速0.5 mL·min-1，检测波长设置3个，分别是190～450 nm、254 nm、360 nm。流动相选择缓冲盐(0.1%甲酸，25 mmol甲酸铵)(流动相A)和100%乙腈(流动相B)，洗脱时间为11 min(刘璇等，2013；冯光维等，2016)。洗脱梯度见表1。

表1 UPLC洗脱梯度程序Table 1 Elution gradient program of UPLC

实验初期，选择流动相A(0.1%乙酸)、流动相B(100%乙腈)时，出峰效果不理想，分离度差，有拖尾现象；后加入缓冲盐，改用流动相A(0.1%甲酸和25 mmol甲酸铵)后，峰型明显改善，达到了预期的分离效果。

在选择检测波长时，190～450 nm为全波长；280 nm是PCA的最大吸收波长；360 nm处的特征吸收峰可以帮助鉴定特征物质，因此，选择在190～450 nm、254 nm、360 nm下同时检测。为了满足美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中高极性成分的分析要求，选用T3色谱柱代替常用的C18色谱柱。结果显示，T3色谱柱能准确分析原液中的目标成分，适用于本实验建立的洗脱方法。

为了能够快速出峰，首先建立9 min的洗脱程序，并未出现PCA的特征峰；当优化条件至11 min，在3.3 min处洗脱出分离度较好的单峰，经外标法鉴定为PCA，且原液以及PCA对照品的目标峰分离度良好。

2.2 美洲大蠊乙醇提取物的UPLC分析

美洲大蠊乙醇提取物在3.3 min处所出峰与PCA的保留时间一致，且两者在3.3 min提取的光谱图均相同(图1：A，B)；向3 mL美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中加入1 mg PCA对照品后，进样1 μL分析(图1：C)，与美洲大蠊乙醇提取物1号峰的出峰时间完全吻合，且峰高及峰面积明显升高，表明1号峰就是目标成分——PCA。

2.3 方法学实验结果

以PCA浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，取5个系列浓度依次进样分析，绘制标准曲线。结果表明，在10～160 μg·mL-1内，PCA浓度与峰面积呈线性关系，方程为y=7 188.6x+5 371.7，R2=0.999 9(图2)。

精密度实验测得RSD为0.59%，稳定性实验与重复性实验的RSD分别为0.80%和0.73%，均小于1%，表明仪器的精密度、样品的稳定性以及方法的重复性良好。

加样回收实验结果表明，PCA的平均回收率为98.30%～99.57%，RSD分别为0.40%、0.64%、0.30%，3组回收率均大于98%，RSD均小于1%，符合统计学分析标准，证明样品及实验仪器稳定，本方法具有良好的回收率(表2)。

图1 美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液(A)、原儿茶酸(B)和加样对照组(C)的超高效液相色谱Fig. 1 Ultra performance liquid chromatography of ethanol extract of Periplaneta americana (A)， protocatechuic acid (B) and control group (C)

a. 1号峰的光谱图， b. 原儿茶酸的光谱图

a. spectrum of No.1 peak， b. spectrum of protocatechuic acid

图2 原儿茶酸标准曲线Fig.2 The standard curve of protocatechuic acid

2.4 样品中PCA的定量分析

根据标准曲线，求得1 mL美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中含有51.38 μg PCA，即美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中PCA的浓度为51.38 μg·mL-1。

3 讨论

周燕园(2014)基于高效液相色谱法比较了乙腈-磷酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-水溶液等流动相系统，最终确定以甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相时，醋五味子配方颗粒中PCA的分离度最好。但传统的高效液相色谱法分析耗时长、消耗人力物力大。与之相比，UPLC法分析快速、稳定性和重复性高，可大大提高分析效率。刘冰等(2015)使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱建立益智仁的UPLC指纹图谱，并标定出PCA特征峰。也

表2 原儿茶酸回收率实验结果Table 2 The recovery rate of protocatechuic acid

有研究采用Waters H-Class UPLC系统以及ACQUITY UPLC BEH C18柱，以甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水体系建立的测定大血藤及潜阳育阴方中PCA含量的方法也相对成熟(刘晓涵，祁龙凯，2016；孟龑等，2017)。本研究首次采用外标法，通过UPLC分析鉴定了美洲大蠊乙醇提取物中的PCA色谱峰，并针对美洲大蠊乙醇提取物的极性及物质组成，在分离度最高、出峰数量最多的前提下采用T3色谱柱建立了定量分析PCA含量的UPLC法。结果表明，PCA在UPLC图谱中的保留时间约3.3 min，本方法重复性好、稳定性高，在分析美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中的PCA时针对性强。本研究建立的PCA定量分析方法为今后定量检测美洲大蠊相关制剂中该成分提供了重要方法，也为美洲大蠊中药制剂的质量控制研究奠定了基础。

近年来，随着对美洲大蠊药用价值研究的不断深入，美洲大蠊中多种药理活性成分不断被发现和报道。PCA已被证实具有抗癌、抗氧化、保护神经、修复缺血损伤等广泛的生物活性。本研究基于UPLC法定量检测了美洲大蠊乙醇提取物中PCA的含量为51.38 μg·mL-1。在UPLC色谱图上，PCA的色谱峰峰面积比其他色谱峰高，表明该成分可能是美洲大蠊乙醇提取物中重要的活性成分之一，从而为阐明美洲大蠊中的药用活性成分提供了重要参考。

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