水环境因子对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响

刘 璐 ，刘 萱 ，王 华 ，*，赵慧敏 ，于春艳 ，冷金慧 ，耿 聪 ，李章良

（1.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023；2.大连理工大学环境学院，辽宁 大连 116024；3.莆田学院环境与生物工程学院，福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，生态环境及其信息图谱福建省高等学校重点实验室，福建 莆田351100；4.国家海洋环境监测中心，辽宁大连 116023）

磺胺类抗生素是一类具有广谱抗菌活性的人畜共用抗菌剂，被广泛用于医疗、畜牧和水产养殖等领域[1]。动物对磺胺类抗生素的排泄率为67%～90%[2]，大量的磺胺类抗生素最终会进入地表水环境中[3]。水环境中的抗生素增加了水中微生物存活的选择性压力，使可携带抗生素抗性基因（Antibiotic resistant genes，ARGs）的耐药微生物成为水环境中的优势种。因而，磺胺类抗生素引发的磺胺类抗性基因污染受到人们的关注。目前，磺胺类抗性基因（Sul1、Sul2和Sul3）已在河流、河口及水产养殖区附近等水环境中检出[4-8]。其中，Sul1是在水环境中含量较高、分布相对广泛的磺胺类抗性基因[9-10]。

天然水环境的水质状况可能会影响抗生素抗性基因的水平转移，进而影响抗生素抗性基因的扩散。Bergeron等[11]对美国路易斯安那州东南部湿地中ARGs的分布特征进行研究发现，盐度对ARGs含量具有显著影响。张俊等[12]研究结果表明，pH变化对四环素ARGs的含量具有显著影响。另外，水中营养元素水平可能对ARGs的分布和传播有直接或间接的影响[13-14]。本研究选取Sul1为目的基因，采用绝对定量PCR技术，考察了5种水环境因子（pH、盐度、腐植酸、总氨氮和活性磷酸盐）对Sul1含量的影响，以期为水环境中磺胺类抗生素抗性基因的生态环境风险评估提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 Sul1型模拟实验菌的构建

从水环境样品中提取基因组DNA，扩增出长度为476 bp的Sul1基因，经1.5%1×TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化后，连接至pMD18-T克隆载体[宝日医生物技术（北京）有限公司]，转入E.coli DH5α感受态细胞中，再通过蓝白斑筛选挑取含目的基因的阳性菌落，37℃恒温振荡培养过夜。采用质粒提取试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司]在所得菌液中提取包含Sul1基因的pMD18-T/Sul1质粒，所得菌液命名为Sul1型模拟实验菌，将质粒送于生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2 Sul1荧光定量PCR方法的建立及标准曲线的绘制

经Nanodrop核酸定量仪测定质粒的浓度及纯度，将标准质粒用超纯水稀释成1010～102copies·μL-1的 9 个浓度，选取 107、106、105、104、103和 102这 6 个浓度作为模板，以0.3 μmol·L-1的Sul1F和Sul1R为特异引物，并加入10 μL的 SYBR Premix Dimer Eraser（2×）、0.4 μL 的 ROX Reference DyeⅡ（50×）和 6.4 μL的无菌水，反应体系20 μL。荧光定量PCR反应条件：95℃预变性 5 min；95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环；72℃延伸7 min。每个反应进行3次重复，并设置空白对照。以SYBR-Green I荧光染料法，应用Step-one定量PCR仪（ABI，美国）绘制Sul1的标准曲线。绘制出的Sul1标准曲线为Y=-3.50lgX+39.03，熔解曲线具有特异性，决定系数R2为0.984，相对效率达96%。荧光定量PCR中所用试剂均购于宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.3 环境因子对Sul1含量的影响

在100 mL锥形瓶中加入10 mL LB肉汤培养基，加入0.01 mL Sul1型模拟实验菌，Sul1的初始浓度为1.10×105copies·mL-1。所有实验均设置 3 组平行，同时设置空白对照。pH对Sul1含量的影响试验：通过150 g·L-1NaOH 或（1+5）HCl溶液调节 LB 肉汤培养基 pH 的初始值分别为 3、4、5、6、7、8、9、10 和 11；盐度对Sul1含量的影响试验：通过NaCl溶液（200 g·L-1）将空白培养基盐度 20 逐渐增加至 25、30、35、40和45；设置LB肉汤培养基的总氨氮（NH3-N）、活性磷酸盐（PO4-P）、腐植酸（HA）的初始浓度分别为 0、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1。所有实验组均经 37 ℃恒温振荡培养24 h后，取1.5 mL菌液，采用MiniBEST Bacteria Genomic DNA试剂盒 [宝日医生物技术（北京）有限公司]提取各实验组的菌液基因组DNA，经过1.5%的 1×TAE 琼脂糖凝胶电泳（220 V，15 min，美国伯乐公司），纯度的测定采用微量核酸定量仪（赛默飞科技有限公司，美国）。Sul1含量的单因素方差分析（One-way ANOVA）应用SPSS 17.0软件计算，其中P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著；并使用O-rigin 8.60进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 pH和盐度对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响

图 1 为 pH 初始值分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0时对Sul1含量的影响。当Sul1的初始浓度为 1.10×105copies·mL-1、pH 值为 3～11时，Sul1基因含量的变化范围为 4.66×104～1.14×108copies·mL-1。当pH值为11时，Sul1的平均含量仅为4.66×104copies·mL-1；而 pH 值为 6 时，Sul1 的平均含量达到1.14×108copies·mL-1，其含量极显著高于酸性（pH 3～5）和碱性（pH 9～11）条件（P＜0.01）。由此可见，中性pH适于抗性大肠杆菌的生长，间接促进了Sul1的含量增加，而酸性和碱性pH条件对Sul1的含量均呈现显著的抑制作用。

pH是重要的水质指标，其过高或过低，都会直接影响水环境中抗性细菌菌落数量，进而影响到ARGs的存在和传播。本实验结果显示pH值为6时，Sul1的平均含量达到1.14×108copies·mL-1，显著高于其他pH条件（P＜0.01），表明ARGs在环境中增殖和传播的最适pH值在6左右。

图1 pH对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响Figure 1 Impact of pH on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

图2为盐度对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响，结果表明盐度对Sul1的含量有着极显著的影响（P＜0.01）。盐度从20上升到45，Sul1含量的变化范围从 1.04×108copies·mL-1下降到 8.34×105copies·mL-1，这意味着盐度增加对Sul1的含量有明显的抑制作用。这可能是在高盐度条件下，细菌为了保持自身生命活动，避免盐度对其内部的生物化学反应造成干扰，细菌细胞膜阻止了绝大部分的外界物质进入，进而影响了Sul1的含量。

图2 盐度对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响Figure 2 Impact of salinity on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

盐度是影响细菌与外部环境发生物质与能量交换的一个重要因素，其高低决定了细菌渗透压的变化，从而直接影响细菌的活性。本研究中盐度从20提高到45，Sul1的含量显著下降了近 3个数量级。Bergeron等[11]对美国路易斯安那州东南部湿地中ARGs的分布特征进行研究，结果显示盐度为6的采样点区域的ARGs分布和含量显著高于盐度为12的采样点区域，这个结果与本实验一致，证实了水环境中盐度可能对ARGs的分布和传播造成影响。

2.2 腐植酸对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响

图3为不同浓度的HA对Sul1含量的影响。当无 HA 时，24 h 后，Sul1含量上升到 1.04×108copies·mL-1。HA 浓度为 0.05 mg·L-1时，Sul1 含量下降至1.00×108copies·mL-1，差异不显著（P=0.130）。而当 HA浓度高于0.05 mg·L-1时，随其浓度的升高，Sul1含量极显著降低（P＜0.01），表明高浓度的HA（大于0.05 mg·L-1）对 Sul1 含量呈现显著的抑制作用（P＜0.01），这可能是由于HA附着在E.coli-sul1细胞膜表面，影响了细胞从培养基中吸收必要的营养物质，间接影响了Sul1的增殖和传播。

图3 腐植酸（HA）对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响Figure 3 Impact of humic acid（HA）on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

HA是天然水环境中广泛存在的重要吸光物质，是水体中色度构成和溶解性有机质（Dissolved organic matter，DOM）的主要成分[15]。HA含有大量的环状（苯环、稠苯环等）结构和多种官能团（羧基、酚羟基、酮基、胺基等），易与水环境中的抗生素或金属离子形成络合物或螯合物[16]。近年来，Chen等[17]研究表明，水溶液中DOM的存在，使四环素与其形成络合物，降低了四环素对E.coli的生物有效性，进而减弱了ARGs的筛选压力。本研究结果进一步证实，即使抗生素不存在时，高浓度的HA可能直接影响磺胺类抗性基因Sul1在水环境中的传播。

2.3 总氨氮和活性磷酸盐对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响

图4为NH3-N对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响。由图4可见，低浓度的NH3-N对Sul1的含量呈促进作用，而高浓度呈抑制作用。当无NH3-N存在时，培养24 h后，Sul1基因含量达到7.30×107copies·mL-1；随着 NH3-N 浓度提高到 0.05 mg·L-1，Sul1含量增长到 9.97×107copies·mL-1；NH3-N 浓度为 0.05～0.2 mg·L-1时，对 Sul1 含量表现出促进作用（P＜0.05）；NH3-N浓度为0.5 mg·L-1时，对Sul1含量具有抑制作用；当NH3-N浓度提高到1 mg·L-1，Sul1含量降低到 5.87×107copies·mL-1。可见 NH3-N 浓度高于 0.5 mg·L-1时，对Sul1含量具有显著的抑制作用（P＜0.05）。

图4 总氨氮（NH3-N）对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响Figure 4 Impact of ammonia nitrogen（NH3-N）on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

图5 活性磷酸盐（PO4-P）对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响Figure 5 Impact of available phosphate（PO4-P）on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

图5为PO4-P对磺胺类抗性基因Sul1含量的影响。图5表明，当无PO4-P时，Sul1含量为7.30×107copies·mL-1。当 PO4-P 浓度为 0.05 mg·L-1时，Sul1 含量达到1.19×108copies·mL-1，高出对照实验组1个数量级，揭示低浓度的PO4-P对Sul1含量呈显著的促进作用（P＜0.05）；但当 PO4-P 浓度为 0.5 mg·L-1时，Sul1 含量为 7.56×107copies·mL-1，与对照组相比差异不显著（P=0.403）；而 PO4-P 浓度为 1 mg·L-1时，Sul1含量仅为 5.15×107copies·mL-1，被显著抑制（P＜0.05）。

氮和磷都是水环境中的营养元素，本研究考察了总氨氮和活性磷酸盐对Sul1含量的影响，研究结果显示低浓度的氮、磷对目的基因的含量变化呈促进作用，而高浓度则呈现显著的抑制作用。Guo等[18]研究结果表明，与缺乏氮或磷条件相比，当氮、磷和葡萄糖同时存在时，细菌ARGs接合转移的转化效率提高近2倍，而与仅存葡萄糖相比，转化效率提高近100倍，实验结果进一步证明氮、磷的存在对ARGs在环境中的迁移和转化有显著的影响。

3 结论

水环境因子对水中磺胺类抗性基因Sul1的存在及分布可能产生极其重要的影响，pH 3～5、pH 9～10、高盐度（25～45）、高HA浓度和高氮磷浓度对Sul1含量均呈显著的抑制作用，低浓度氮磷对Sul1含量起促进作用。

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