凝结芽孢杆菌益生机制及应用研究进展

郭庆丰，陈林，*，马经纬

（1.黄河科技学院，河南郑州450063；2.郑州市药用资源研究重点实验室，河南郑州450063）

益生菌是指一类服用足够数量能够对宿主健康有益的活性微生物，其主要作用在于其进入肠道后能够维持肠道菌群的平衡，促进有益菌的繁殖和抑制致病菌生长，因此对人体健康有益[1-2]。凝结芽孢杆菌既能像乳酸菌和双歧杆菌具有益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性强、耐高温高压和易贮藏等优点，能够改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫水平、促进营养物质代谢和利用，是近年来研究的热门菌种。本文主要对凝结芽孢杆菌概况、生物学特性、益生作用机理、安全性、微生态制剂及临床应用研究等方面进行综述。

1 凝结芽孢杆菌概况

1915年，Hammer[3]首次从凝结的变质牛奶中分离出凝结芽孢杆菌（B.coagulans），1932 年，Sarles等[4]对凝结芽孢杆菌进行了详细描述，同年，Horowitz-Wlassowa和Nowotelnow首次用芽孢乳酸菌（Lactobacillus sporogenes）来描述凝结芽孢杆菌，由于其含有乳酸菌和芽孢杆菌的双重特性，其分类一直存在争议，直到第八版的《伯杰氏鉴定细菌学手册》（Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology）将接触酶阳性的，嗜热的乳杆菌归于芽孢杆菌属，将其重新分类，统一规范命名了凝结芽孢杆菌[5]。凝结芽孢杆菌在1989年被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）评为“普遍认为安全”的一类杆菌，此外该菌被评价为缺乏产毒潜能，获得了欧洲欧盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）的安全资格认定（Qualified Presumption of Safety，QPS）[6-7]。该菌在日本、美国、欧洲等地已经被应用于药品、食品和饲料添加剂等行业[8-11]。我国农业部亦于2004年在第372号公告中，批准了天津市新星兽药厂将凝结芽孢杆菌TQ33作为仔鸡和生长育肥猪的食品添加剂的申请[12]。2005年，由青岛东海药业有限公司生产的凝结芽孢杆菌活菌片，也获得国家食品和药品监督管理局新药证书[13]。

2 凝结芽孢杆菌生物学特性

凝结芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，营养细胞呈杆状，两端钝圆，单个、成对、少数呈短链状，芽孢端生，无鞭毛，最适生长温度为45℃～50℃，最适pH为6.6～7.0，其能分解小分子糖类生成L-1乳酸，为同型乳酸发酵菌，过氧化氢酶阳性[14-15]。凝结芽孢杆菌除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐胃酸、耐热、耐胆碱盐、降解亚硝酸盐、容易培养和保存等特点。赵虎山等[11]发现凝结芽孢杆菌TQ33经90℃，60 min湿热和120℃，60 min干热处理，其活菌数只下降1个数量级；将其置于pH大于2.42的酸性溶液中，存放1年后，其存活率仍高达105；凝结芽孢杆菌NJ102在pH 2.5的模拟胃液中处理12 h，存活率为71.9%。在胆盐浓度0.3%和pH 8.0的模拟肠液中处理12 h，存活率为84.4%，该菌可有效降解亚硝酸盐，48 h降解率达到96.8%[16]。

3 益生作用机理

凝结芽孢杆菌作为益生菌中的一种，目前还未见其益生作用机制的确切报道，不过学者普遍认为其在肠道中所起的生理调节功效并非单一物质的作用，而是其分泌多种代谢产物以及与肠道其它益生菌协同作用的结果。

3.1 调节消化道微生态平衡

凝结芽胞杆菌是一种兼性厌氧菌，能适应肠道内低氧环境，进入肠道后，在肠道内定植，通过消耗游离氧，抑制需氧型有害菌的生长，同时促进厌氧益生菌如乳酸菌、双歧杆菌等的增殖；产生乳酸降低肠道pH值，并分泌多种抗菌的细菌素类多肽物质如凝固素等，能够抑制肠道有害菌的生长，从而有效恢复并维持肠道微生态平衡，进而提高生物体免疫力，减少肠道疾病的发生。除此之外，它能产生双乙酰、有机酸等多种代谢产物，减少胺类等有害物质的产生，不仅能改善肠道内微生态环境，同时也改善体外环境，从而减少疾病的发生与传播[17-18]。

3.2 促进机体对营养物质的消化吸收

凝结芽孢杆菌可以通过3种方式促进机体对营养物质的吸收利用。一是促进产生多种消化酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶及乳酸脱氢酶等有助于提高胃肠道对食物消化，降解难以被宿主消化的复杂碳水化合物，如果胶、葡聚糖、乳糖、纤维素和木聚糖等[19-23]；二是在肠道内生长、繁殖和定植后，其自身能直接产生多种营养物质供机体吸收利用，如氨基酸、维生素、短链脂肪酸和促生长因子等，它们同其它益生菌协同作用促进小肠蠕动，改善肠道功能，从而促进机体对营养物质的消化与吸收；三是可以通过产生乳酸促进动物机体对铁、磷、钙和维生素D等的吸收[12-13]。

3.3 提高免疫力，增强抗病力

益生菌能够提高免疫系统的免疫能力，增强吞噬细胞的活性，增加胃肠道等器官对病原微生物的抵抗能力[24-26]。体外试验表明，凝结芽孢杆菌的发酵上清液及细胞壁成分可通过调节细胞因子、抑制活性氧和增强细胞吞噬作用来提高肠道免疫能力，另外凝结芽孢杆菌能促进消化道粘膜发生免疫反应[27-28]。Baron等[29]研究证明，凝结芽孢杆菌GBI-30能够提高T细胞中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，可用来防治腺病毒和甲型流感病毒等特定病毒感染。王文杰等[30]发现，凝结芽孢杆菌TBC169能显著提高免疫功能低下小鼠的免疫功能，减少正常小鼠肠道中胺和氨的含量，从而增强机体抵抗力和保护机体。

4 安全性

益生菌一直被认为是安全的，但也有研究发现益生菌能造成宿主机体感染，产生有害代谢产物，产生过度的免疫反应以及引起耐药基因的转移等，给一些人群带来安全隐患，并且临床上也出现了服用益生菌制剂致病的案例[30]。不过欧洲食品安全局认为凝结芽孢杆菌是对所有抗生素都是敏感的，不携带耐抗生素基因；毒理学安全性实验表明，凝结芽孢杆菌没有无致诱变，致畸变以及遗传毒性效应。Endress等[31-32]报道，凝结芽孢杆菌对大鼠的急性和90 d的亚慢性口服毒性实验结果显示其无明显毒害剂量为1 000 mg/（g·d），活菌浓度为1.36×1011CFUs/g，相当于平均重70 kg，其安全口服剂量为95.2×1011CFUs。为了进一步研究凝结芽孢杆菌安全性，他们又对其进行了长达一年的慢性口服毒性联合繁殖毒性研究，其结果表明凝结芽孢杆菌没有对大鼠亲代及其子孙显示任何毒性。且对于一个70 kg的人来说，长期每天摄入量为9.38×1010CFUs的凝结芽孢杆菌是安全的。

Majeed等[33-34]发现凝结芽孢杆菌MTCC 5856不会像其他芽孢杆菌一样产生肠毒素，也不含有肠毒素基因，没有明显的细胞毒性，且不会产生诱变效应，能够在常温下存活3年。凝结芽孢杆菌在烘焙食品、饮料、植物油、浓缩糖浆甚至煮咖啡中都非常稳定。

凝结芽孢杆菌的代谢产物中具有广谱抗菌效果的多肽类细菌素物质，通过MTT实验证明没有明显细胞毒性，且能够被蛋白酶水解[35-36]。

5 凝结芽孢杆菌在微生态制剂方面的应用

微生物菌剂是指利用益生菌的生长及其代谢产物制成的活菌制剂，具有调整维持动物肠道微生态平衡、促进机体胃肠道吸收、提高免疫力的作用。凝结芽孢杆菌由于具有抗逆性强、耐高温高热、易贮藏等特性，能顺利通过胃酸和消化酶的双重作用进入肠道定植，并在肠道迅速复苏成为活菌，发挥其对动物肠道的保健作用，凝结芽孢杆菌这些特性决定了其作为一种微生态制剂在水产养殖及家禽养殖方面有很好的应用前景。

5.1 凝结芽孢杆菌制剂在水产养殖方面的应用

在水产养殖中，水产动物代谢物以及养殖水体的富营养化问题日趋严重，各种有害物质或有机物在养殖水体中大量积累富集[37]。利用抗生素防治病害是最直接有效的方法，然而抗生素会产生耐药性以及对养殖水体造成污染。高密度养殖模式导致抗生素滥用和残留禁用抑菌试剂对水产养殖的健康发展造成了严重危害。益生菌能够抑制有害菌并优化水体菌群结构达到水体内生态平衡，已被广泛应用于水产养殖[38]。

凝结芽孢杆菌能够分解养殖水体中的大分子有机物，并大量消耗水体中的有机物转化为无机盐从而改良水质，且可以为单细胞藻类提供营养[39]。藻类的光合作用为微生物和水产动物的呼吸提供氧气，达到养殖水体的良性循环，使水体中的致病菌得到抑制[40]，既解决了水产动物酶制剂易失活和热稳定性差的缺陷，又有效抑制了抗药性的产生。因此，凝结芽孢杆菌应用于水产养殖能够减少甚至消灭水产养殖动物病害的发生，最终提高水产品品质。

国外有研究表明，芽孢杆菌能够增加肠粘膜的厚度、肠绒毛的高度和密度，进而有效促进肠道发育[41]。袁丰华等[42]将凝结芽孢杆菌添加在尖吻鲈的饲料中连续投喂50天后，尖吻鲈的增重率提高了9.45%。匡群等[43]在团头鲂养殖饲料中单独添加凝结芽孢杆菌，团头鲂的特定生长率、蛋白质效率、肠道凝结芽孢杆菌数量和蛋白酶活力显著提高，饲料系数和肠道大肠埃希菌数量显著降低。张维娜等[44]将不同含量的凝结芽孢杆菌添加到异育银鲫幼鱼饲料中发现添加0.3%凝结芽孢杆菌可较好地促进异育银鲫幼鱼的生长，提高机体免疫力。在饲料中添加0.3%、0.5%凝结芽孢杆菌能够显著提高鱼体的增质量率、特定增长率、肝脏的总抗氧化能力及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，并能够显著降低饵料系数；添加0.5%凝结芽孢杆菌能显著提高碱性磷酸酶、谷草转氨酶活性及总蛋白质含量；添加0.3%凝结芽孢杆菌能显著降低碱性磷酸酶、谷丙转氨酶活性；添加0.1%凝结芽孢杆菌能显著降低碱性磷酸酶活性，显著提高肝脏的过氧化氢酶活性。汪波等[45]将凝结芽孢杆菌添加至凡纳滨对虾幼虾饲料中饲养20 d发现随着凝结芽孢杆菌添加量的增加，试验组凡纳滨对虾的增质量率和特定生长率增高，同时显著降低饵料系数，提高养殖的存活率，超氧化物歧化酶和碱性磷酸酶活性增加。说明添加凝结芽孢杆菌可在一定程度上提高凡纳滨对虾幼虾的生长性能和改善其非特异性免疫力。

5.2 凝结芽孢杆菌制剂在家禽养殖方面的应用

研究表明凝结芽孢杆菌制剂对家禽动物鸡、猪等的生长性能、机体免疫功能也具有比较显著的影响。赵娜等[46]对凝结芽孢杆菌对肉鸡的生长性能、免疫器官指数、血清生化指标及肠道菌群的影响进行研究，结果显示，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可抑制肉鸡肠道中大肠杆菌的生长，提高免疫器官指数，降低死淘率。黄世猛等[47]发现凝结芽孢杆菌可改善蛋鸡生产性能和蛋品质，在蛋白质代谢、脂质代谢、肝功能和钙磷吸收上都具有一定程度的改善作用。高书锋等[48]研究发现饲粮中添加0.15%凝结芽孢杆菌制剂可提高断奶仔猪生长性能、降低粪样致病菌数量、提高粪样有益菌数量和改善养殖环境。洪文等[49]研究也表明，适量凝结芽孢杆菌可以提高断奶仔猪生长性能，减少腹泻。

6 临床研究

凝结芽孢杆菌由于具有调节肠道微生态平衡、促进消化吸收和增强免疫力等生物学功能，且安全有效，越来越多的国内外学者开始关注凝结芽孢杆菌临床应用研究。凝结芽孢杆菌除了对慢性结肠炎、腹泻和便秘、呼吸道感染、阴道炎等疾病均有显著的治疗效果，还具有调节肌肉损伤和提高免疫力的功效。

大量临床研究表明，凝结芽孢杆菌可以用来治疗肠道易激综合症、肠道失调综合症等，能够减小腹泻、腹胀、腹痛、呕吐、排便次数和增强肠道运动性[50-53]。Dutta等[54]评估了凝结芽孢杆菌作为益生菌类微生物菌剂对小儿腹泻的临床疗效，结果显示凝结芽孢杆菌进入肠道分泌大量乳酸，恢复肠动力，抑制肠道有害菌并排除肠毒素，恢复肠道菌群平衡。2009年，国外学者[29]研究发现凝结芽孢杆菌能够增加感染甲型流感病毒患者的T细胞产生TNF-肿瘤坏死因子。侯占英、黎素清[55-56]发现凝结芽孢杆菌活菌片能够降低3岁以下小儿反复呼吸道感染发生率，减少抗生素的使用。

Ralf等[57]发现补充凝结芽孢杆菌联合蛋白能够降低肌肉损伤，加快复原。Jepner等[58]报道了凝结芽孢杆菌能够增强2-甲基-2-羟基丁酸钙（β-hydroxy-βmethylbutyrate calcium，CaHMB）（一种被证实能够增强高强度训练导致的肌肉损伤）对军事训练引起肌肉损伤的复原，并能引起细胞因子反应。

Riazi等[59]将凝结芽孢杆菌发酵液浓缩10倍检测对阴道炎致病菌藤黄微球菌的抑制作用，结果显示凝结芽孢杆菌是一种安全有效的抑菌制剂；翟新茹等[60]将凝结芽孢杆菌活菌片联合甲硝唑栓治疗细菌性阴道病疗效显著，能降低复发率。以上研究表明凝结芽孢杆菌在细菌性阴道炎的治疗中具有潜在应用价值。

此外，凝结芽孢杆菌能够预防新生儿黄疸[61]，对风湿性关节炎[28]、口疮性口炎、龋齿[62]、婴儿湿疹[63]等疾病具有临床应用价值。

7 小结与展望

微生物发酵产物作为抑菌制剂具有天然高效的优点，是化学药物和抗生素的理想替代品。目前，对其应用的相关研究较多，作用机理研究较少，其安全性评价也不够全面。虽然部分微生物来源的抑菌制剂已经投入市场，但是天然抑菌制剂较高的价格以及其安全性评价不足阻碍了其更进一步推广和应用，仅有细菌素Nisin（Nisin是一种细菌素）等少数物质被发现并应用。研究人员进一步对产生相关抑菌物质的菌株进行遗传改良，进而提高产量，降低生产成本，对高效安全并且经济实用的天然抑菌制剂的开发具有重要意义。

凝结芽孢杆菌的代谢产物研究较少，仅限于具有抑菌活性的多肽类和抗氧化活性的多糖类大分子的研究，其代谢产物除了有机酸、胺外，尚未见其它小分子报道。凝结芽孢杆菌可以提高机体免疫能力，但其起免疫作用的物质基础还不明确，因此对凝结芽孢杆菌免疫作用的物质基础进行进一步开发利用具有重要意义。

总之，凝结芽孢杆菌作为抑菌制剂的研究尚属起步阶段，但随着学者们对其研究的进一步深入，包括抑菌物质基础研究、抑菌机制探索以及提取工艺的优化等，凝结芽孢杆菌必将在食品安全方面发挥重要作用。同时作为绿色高效抑菌制剂的应用范围将更加广泛。